PCR ප්රතික්රියාකාරකවල මුල් අවධියේදී ප්රයිමර් සහ පරීක්ෂණවල ක්රියාකාරීත්වය තහවුරු කිරීම සහ වඩාත් සුදුසු ප්රතික්රියා තත්ත්වයන් නිර්ණය කිරීම විධිමත් පරීක්ෂණවල සුමට ප්රගතිය සහතික කිරීම සඳහා පූර්වාවශ්යතා වේ.
ඉතින් අපි මුල් අවධියේදී ප්රයිමර් පරීක්ෂණය තහවුරු කිරීමට අවශ්ය වන්නේ කෙසේද?
ප්රධාන දර්ශක වන්නේ මූලික, විස්තාරණ වක්රය, ct අගය, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව, අඩු සාන්ද්රණ සාම්පල හඳුනාගැනීම, CV යනාදියයි.
මූලික රේඛාව
මූලික රේඛාව PCR විස්තාරණ වක්රයේ තිරස් රේඛාවයි.PCR වර්ධක ප්රතික්රියාවේ පළමු චක්ර කිහිපය තුළ ප්රතිදීප්ත සංඥාව බොහෝ වෙනස් නොවන අතර සරල රේඛාවක් සාදයි.මෙම සරල රේඛාව මූලික රේඛාවයි.
PCR ප්රයිමර් පරීක්ෂණ පිරික්සීමේදී, මූලික මට්ටම මට්ටමේ තිබේද යන්න පිළිබඳව අවධානය යොමු කරන්න.ප්රාථමික පරීක්ෂණ සාන්ද්රණයේ සංශුද්ධතාවය මූලික රේඛාවට බලපානු ඇත, එනම් මූලික රේඛාව ඉහළට හෝ වැටීමට හේතු වේ.මූලික රේඛාව ද ඉතා අවබෝධාත්මක දර්ශකයකි.
විස්තාරණ වක්රය
තවත් බුද්ධිමය දර්ශකයක් වන්නේ විස්තාරණ වක්රයේ හැඩයයි.ද්විතියික විස්තාරණය හෝ වෙනත් අසාමාන්ය විස්තාරණ වක්ර වළක්වා ගැනීම සඳහා S-හැඩැති වක්රයක් තිබීම වඩාත් සුදුසුය.
Ct අගය
මූලික රේඛාවේ සිට ඝාතීය වර්ධනය දක්වා ආවර්ත ලක්ෂ්යයට අනුරූප වන චක්ර ගණන Ct අගය වේ.
එකම නියැදිය සඳහා, විවිධ ප්රාථමික පරීක්ෂණ විවිධ විස්තාරණ වක්රවල ප්රතිඵලයක් වන අතර, අනුරූප Ct අගය විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සහ මැදිහත්වීම් මට්ටමට බලපානු ඇත.න්යායට අනුව, අපි තෝරා ගන්නා ප්රයිමර් පරීක්ෂණයේ Ct අගය කුඩා වන තරමට වඩා හොඳය.
විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව
PCR විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව ඇගයීම සඳහා වඩාත්ම විශ්වාසදායක සහ ස්ථාවර ක්රමයක් වන්නේ පර්යේෂකයන් විසින් පුළුල් ලෙස හඳුනාගෙන ඇති සම්මත වක්රයයි.ඉලක්ක සැකිලි සාපේක්ෂ සංඛ්යාව පාලනය කිරීම සඳහා සාම්පල මාලාවක් සෑදීම ක්රමයට ඇතුළත් වේ.මෙම සාම්පල සාමාන්යයෙන් සාන්ද්රිත කොටස් ද්රාවණවල අනුක්රමික තනුක කිරීම් මගින් සාදනු ලැබේ, බහුලව භාවිතා වන්නේ 10 ගුණයකින් තනුක කිරීමයි.තනුක කළ සාම්පල මාලාවක් භාවිතා කිරීම, Cq අගය ලබා ගැනීම සඳහා විස්තාරණය කිරීම සඳහා සම්මත qPCR වැඩසටහන භාවිතා කිරීම සහ අවසානයේ එක් එක් සාම්පලයේ සාන්ද්රණය සහ අනුරූප Cq අගය අනුව රේඛීය සමීකරණය Cq= -klgX0+b සහ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව E=10(-1 /k)-1 ලබා ගැනීම සඳහා සම්මත වක්රයක් අඳින්න.ප්රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය සඳහා qPCR භාවිතා කරන විට, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 90%-110% (3.6>k>3.1) පරාසයක තිබීම අවශ්ය වේ.
අඩු සාන්ද්රණ සාම්පල හඳුනාගැනීම
නියැදි සාන්ද්රණය අඩු වූ විට, විවිධ ප්රාථමික පරීක්ෂණවල හඳුනාගැනීමේ අනුපාත වෙනස් වේ.අපි ප්රතිනිර්මාණය කිරීම සඳහා අඩු සාන්ද්රණ සාම්පල 20ක් තෝරා ගන්නා අතර, ඉහළම හඳුනාගැනීමේ අනුපාතය සහිත ප්රයිමර්-පරීක්ෂණ පද්ධතිය හොඳම වේ.
විචල්ය සංගුණකය (CV)
න්යෂ්ටික අම්ල වර්ධක හඳුනාගැනීම සඳහා ප්රතික්රියාකාරකයේ රේඛීය ප්රමිතියට අනුව විවිධ ප්රාථමික පරීක්ෂණ මගින් අනුපිටපත් සාම්පල 10ක් හඳුනාගත හැක.
ප්රමාණාත්මක ප්රතික්රියාකාරක:
නිරවද්යතාව
එක් කණ්ඩායමක් තුළ නිරවද්යතාවය සපුරාලිය යුතුය: පරීක්ෂණ සාන්ද්රණයේ ලඝුගණක අගයෙහි විචලනයේ සංගුණකය (CV,%) ≤5% වේ.නියැදි සාන්ද්රණය අඩු වූ විට, හඳුනාගැනීමේ සාන්ද්රණයේ ලඝුගණකයේ විචලනයේ සංගුණකය (CV,%) ≤10% වේ.
ගුණාත්මක ප්රතික්රියාකාරක:
නිරවද්යතාව
එක් කණ්ඩායමක් තුළ නිරවද්යතාවය සපුරාලිය යුතුය:
(1) Ct අගයෙහි විචලනයේ සංගුණකය (CV,%) ≤5%
එකම නියැදිය 10 වතාවක් සමාන්තරව පරීක්ෂා කරනු ලබන අතර, පරීක්ෂණ ප්රතිඵල අනුකූල විය යුතුය
පසු කාලය: සැප්-18-2021