• ෆේස්බුක්
  • linkedin
  • youtube

 ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR (තැක්මන් PCR ලෙසද හැඳින්වේ, මින් ඉදිරියට FQ-PCR ලෙස හැඳින්වේ) යනු 1995 දී එක්සත් ජනපදයේ PE (පර්කින් එල්මර්) විසින් වැඩි දියුණු කරන ලද නව න්‍යෂ්ටික අම්ල ප්‍රමාණාත්මක තාක්‍ෂණයකි.නම්‍යශීලී PCR හා සසඳන විට, FQ-PCR හට එහි ප්‍රමාණාත්මක ක්‍රියාකාරිත්වය අවබෝධ කර ගැනීමට බොහෝ වාසි ඇත.මෙම ලිපියෙන් අදහස් කරන්නේ තාක්ෂණයේ ලක්ෂණ, මූලධර්ම, ක්‍රම සහ යෙදුම් කෙටියෙන් විස්තර කිරීමටයි.

1 විශේෂාංග

FQ-PCR හට සාමාන්‍ය PCR හි ඉහළ සංවේදීතාවයක් පමණක් නොව, ප්‍රතිදීප්ත ගවේෂණ යෙදීම නිසාද, ප්‍රකාශ විද්‍යුත් සන්නායක පද්ධතිය හරහා PCR වර්ධකයේදී ප්‍රතිදීප්ත සංඥා වෙනස්වීම සෘජුවම හඳුනාගෙන ප්‍රමාණාත්මක ප්‍රතිඵල ලබා ගත හැකි අතර, එමඟින් සාම්ප්‍රදායික PCR හි බොහෝ අඩුපාඩු මඟහරවා ගත හැකිය.

උදාහරණයක් ලෙස, සාමාන්‍ය PCR නිෂ්පාදන පාරජම්බුල කිරණ සමඟ ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය සහ එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ් පැල්ලම් කිරීම හෝ පොලිඇක්‍රිලමයිඩ් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් සහ රිදී පැල්ලම් මගින් නිරීක්ෂණය කළ යුතුය.මේ සඳහා විවිධ උපකරණ අවශ්ය පමණක් නොව, කාලය හා වෑයම ද අවශ්ය වේ.Ethidium Bromide භාවිතා කරන ලද පැල්ලම් මිනිස් සිරුරට හානිකර වන අතර, මෙම සංකීර්ණ පර්යේෂණ ක්‍රියා පටිපාටි දූෂණයට සහ ව්‍යාජ ධනාත්මක සඳහා අවස්ථා සපයයි.කෙසේ වෙතත්, FQ-PCR හට නියැදි පැටවීමේදී පියන විවෘත කිරීමට අවශ්‍ය වන්නේ එක් වරක් පමණක් වන අතර, පසුකාලීන ක්‍රියාවලිය සම්පුර්ණයෙන්ම සංවෘත නල ක්‍රියාවක් වන අතර, එයට PCR පසු සැකසුම් අවශ්‍ය නොවේ, සාම්ප්‍රදායික PCR මෙහෙයුම් වල බොහෝ අවාසි මග හැරේ.අත්හදා බැලීම සාමාන්‍යයෙන් PE සමාගම විසින් වැඩි දියුණු කරන ලද ABI7100 PCR තාප චක්‍රය භාවිතා කරයි.

උපකරණයට පහත ලක්ෂණ ඇත: ① පුළුල් යෙදුම: එය DNA සහ RNA PCR නිෂ්පාදන ප්‍රමාණකරණය, ජාන ප්‍රකාශන පර්යේෂණ, රෝගකාරක හඳුනාගැනීම සහ PCR තත්ත්වයන් ප්‍රශස්ත කිරීම සඳහා භාවිතා කළ හැක.② අද්විතීය ප්‍රමාණාත්මක මූලධර්මය: ප්‍රතිදීප්ත ලේබල් කරන ලද ගවේෂණ භාවිතා කරමින්, ප්‍රමාණකරණයේ අරමුණ සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා, ලේසර් උද්දීපනයෙන් පසු ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණය PCR චක්‍රය සමඟ එකතු වේ.③ ඉහළ කාර්යක්‍ෂමතාව: 9600 PCR තාප චක්‍රය, නියැදි 96 ක් ස්වයංක්‍රීයව සහ සමමුහුර්තව විස්තාරණය කිරීම සහ ප්‍රමාණ කිරීම සම්පූර්ණ කිරීම සඳහා පරිගණකය පැය 1 සිට 2 දක්වා පාලනය කරයි.④ ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය අවශ්‍ය නොවේ: නියැදිය තනුක කර විද්‍යුත් විච්ඡේදනය කිරීමට අවශ්‍ය නැත, ප්‍රතික්‍රියා නාලය තුළ කෙලින්ම හඳුනා ගැනීමට විශේෂ පරීක්ෂණයක් භාවිතා කරන්න.⑤ නල මාර්ගයේ කිසිදු දූෂණයක් නොමැත: අද්විතීය සම්පුර්ණ සංවෘත ප්‍රතික්‍රියා නළය සහ ප්‍රකාශ විද්‍යුත් සන්නායක පද්ධතිය භාවිතා කර ඇත, එබැවින් දූෂණය ගැන කරදර විය යුතු නැත.⑥ප්‍රතිඵල ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකි ය: ප්‍රමාණාත්මක ගතික පරාසය විශාලත්වයේ ඇණවුම් පහක් දක්වා වේ.එබැවින්, මෙම තාක්ෂණය සාර්ථකව සංවර්ධනය කරන ලද බැවින්, එය බොහෝ විද්යාත්මක පර්යේෂකයන් විසින් අගය කර ඇති අතර බොහෝ ක්ෂේත්රවල භාවිතා කර ඇත.

2 මූලධර්ම සහ ක්රම

FQ-PCR හි ක්‍රියාකාරී මූලධර්මය වන්නේ PCR ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියට ප්‍රතිදීප්ත ලේබල් කළ පරීක්ෂණයක් එක් කිරීමට Taq එන්සයිමයේ 5′→3′ exonuclease ක්‍රියාකාරකම් භාවිතා කිරීමයි.ප්‍රයිමර් අනුපිළිවෙලෙහි අඩංගු DNA අච්චුව සමඟ පරීක්ෂණයට විශේෂයෙන් දෙමුහුන් කළ හැක.පරීක්ෂණයේ 5′අන්තය fluorescence emission gene FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescence emission peak at 518nm) සමඟින් ලේබල් කර ඇති අතර, 3′end fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylmition at5) ලෙස ලේබල් කර ඇත. PCR විස්තාරණය කිරීමේදී පරීක්ෂණය දිගු වීම වැළැක්වීම සඳහා පරීක්ෂණයේ ආරම්භය පොස්පරීකරණය කර ඇත.පරීක්ෂණය නොවෙනස්ව පවතින විට, නිවාදැමීමේ කණ්ඩායම විමෝචන කාණ්ඩයේ ප්‍රතිදීප්ත විමෝචනය මර්දනය කරයි.විමෝචක කණ්ඩායම නිවාදැමීමේ කණ්ඩායමෙන් වෙන් වූ පසු, නිෂේධනය ඉවත් කරනු ලබන අතර, 518nm හි දෘශ්‍ය ඝනත්වය වැඩි වන අතර ප්‍රතිදීප්ත හඳුනාගැනීමේ පද්ධතිය මඟින් අනාවරණය වේ. ප්‍රතිනිර්මාණ අවධියේදී, පරීක්ෂණය DNA සැකිල්ල සමඟ දෙමුහුන් වන අතර, විස්තීරණ අවධියේ Taq එන්සයිමය DNA සමඟ ප්‍රයිම් ටෙම්ප්ලේටය ඔස්සේ ගමන් කරයි.පරීක්ෂණය කපා දැමූ විට, නිවාදැමීමේ බලපෑම මුදා හරින අතර ප්රතිදීප්ත සංඥාව නිකුත් වේ.අච්චුව පිටපත් කරන සෑම අවස්ථාවකම, ප්රතිදීප්ත සංඥාවක් නිකුත් කිරීමත් සමඟ පරීක්ෂණයක් කපා හැරේ.නිකුත් කරන ලද fluorophores ගණන සහ PCR නිෂ්පාදන ගණන අතර එකින් එක සම්බන්ධයක් ඇති බැවින්, මෙම තාක්ෂණය නිවැරදිව සැකිල්ල ප්‍රමාණනය කිරීමට භාවිතා කළ හැක.පර්යේෂණාත්මක උපකරණය සාමාන්‍යයෙන් PE සමාගම විසින් සංවර්ධනය කරන ලද ABI7100 PCR තාප චක්‍රය භාවිතා කරන අතර අනෙකුත් තාප සයිකල් ද භාවිතා කළ හැක.අත්හදා බැලීම සඳහා ABI7700 ප්‍රතික්‍රියා ආකාරයේ ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රතික්‍රියාව අවසන් වූ පසු, පරිගණක විශ්ලේෂණය හරහා ප්‍රමාණාත්මක ප්‍රතිඵල සෘජුවම ලබා දිය හැකිය.ඔබ වෙනත් තාප චක්‍ර භාවිතා කරන්නේ නම්, RQ+, RQ-, △RQ ගණනය කිරීම සඳහා ප්‍රතික්‍රියා නලයේ ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව එකවර මැනීමට ප්‍රතිදීප්ත අනාවරකයක් භාවිතා කළ යුතුය.RQ+ නිරූපණය කරන්නේ නියැදි නළයේ ප්‍රතිදීප්ත විමෝචන කාණ්ඩයේ ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවයේ අනුපාතය සහ නිවාදැමීමේ කාණ්ඩයේ දීප්තිය තීව්‍රතාවයයි, RQ- හිස් නළයේ ඇති දෙකේ අනුපාතය නියෝජනය කරයි, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) ප්‍රතිදීප්ත ක්‍රියාවලියේදී ලබාගත් දත්ත ප්‍රවාහයේ ප්‍රතිඵලය විය හැක.ප්රතිදීප්ත පරීක්ෂණ හඳුන්වාදීම හේතුවෙන්, අත්හදා බැලීමේ විශේෂත්වය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි දියුණු කර ඇත.ගවේෂණ සැලසුම සාමාන්‍යයෙන් පහත කොන්දේසි සපුරාලිය යුතුය: ①බැඳීමේ විශේෂත්වය සහතික කිරීම සඳහා විමර්ශනයේ දිග පාදම 20-40 පමණ විය යුතුය.② තනි නියුක්ලියෝටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් අනුපිටපත් වීම වැළැක්වීම සඳහා GC භෂ්මවල අන්තර්ගතය 40% සහ 60% අතර වේ.③ දෙමුහුන් කිරීම හෝ ප්‍රයිමර් සමඟ අතිච්ඡාදනය වීම වළක්වන්න.④ පරීක්ෂණය සහ අච්චුව අතර බන්ධනයේ ස්ථායිතාව ප්‍රාථමිකය සහ අච්චුව අතර බන්ධනයේ ස්ථායීතාවයට වඩා වැඩි වේ, එබැවින් පරීක්ෂණයේ Tm අගය ප්‍රාථමිකයේ Tm අගයට වඩා අවම වශයෙන් 5 ° C වැඩි විය යුතුය.මීට අමතරව, පරීක්ෂණයේ සාන්ද්‍රණය, පරීක්ෂණය සහ සැකිලි අනුපිළිවෙල අතර සමජාතීයතාවය සහ පරීක්ෂණය සහ ප්‍රාථමිකය අතර දුර යන සියල්ලම පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල කෙරෙහි බලපෑමක් ඇති කරයි.

ආශ්රිත නිෂ්පාදන:

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I(gDNase සමඟ)(lncRNA වෙතින් පළමු පෙළ cDNA සංස්ලේෂණය සඳහා සුපිරි Premix) නිෂ්පාදකයා සහ සැපයුම්කරු |Foregene (foreivd.com)

චීනයේ රියල් ටයිම් PCR Easyᵀᴹ-Taqman නිෂ්පාදකයා සහ සැපයුම්කරු |Foregene (foreivd.com)


පසු කාලය: ඔක්තෝබර්-15-2021