PCR යනු වඩාත් බහුලව භාවිතා වන න්යෂ්ටික අම්ල විස්තාරණ තාක්ෂණය වන අතර එහි සංවේදීතාව සහ විශේෂත්වය හේතුවෙන් බහුලව භාවිතා වේ.කෙසේ වෙතත්, PCR සඳහා නැවත නැවතත් තාප පිරිහීම අවශ්‍ය වන අතර, සායනික ක්ෂේත්‍ර පරීක්ෂා කිරීමේදී එහි යෙදීම සීමා කරන උපකරණ සහ උපකරණ මත යැපීමේ සීමාවන්ගෙන් මිදිය නොහැක.

1990 ගණන්වල මුල් භාගයේ සිට, බොහෝ රසායනාගාර තාප පිරිහීමට අවශ්ය නොවන නියත උෂ්ණත්ව විස්තාරණ තාක්ෂණය දියුණු කිරීමට පටන් ගෙන ඇත.දැන් ඔවුන් loop-mediated isothermal amplification technology, strand replacement isothermal amplification technology, rolling circle isothermal amplification technology, and nucleic acid sequence dependent දියුණු කර ඇත.සම තාප විස්තාරණ තාක්ෂණය සහ අනෙකුත් තාක්ෂණයන්. 

Loop-මැදිහත් සමෝෂ්ණ විස්තාරණය

වර්ධක මූලධර්මය පදනම් වී ඇත්තේ ඩීඑන්ඒ ගතික සමතුලිතතා තත්වයක 65 ° C පමණ වන බැවිනි.ඕනෑම ප්‍රාථමිකයක් පාදම යුගල කර ද්විත්ව නූල් DNA හි අනුපූරක කොටස දක්වා දිගු කළ විට, අනෙක් කෙඳි විඝටනය වී තනි කෙඳි බවට පත්වේ.

මෙම උෂ්ණත්වයේ දී, ස්ට්‍රාන්ඩ්-විස්ථාපන DNA වල සංශ්ලේෂණය අඛණ්ඩව ස්වයං-සංසරනය කිරීම සඳහා ස්ට්‍රාන්ඩ්-විස්ථාපන DNA පොලිමරේස් මත විශ්වාසය තැබීමට DNA විශේෂිත ප්‍රයිමර් 4ක් භාවිතා කරයි.

මුලින්ම ඉලක්කගත ජානය මත F3, F2, F1, B1, B2, B3 නිශ්චිත කලාප 6 තීරණය කරන්න, ඉන්පසු මෙම විශේෂිත කලාප 6 මත පදනම්ව ප්‍රයිමර් 4ක් සැලසුම් කරන්න (පහත රූපයේ දැක්වෙන පරිදි):

ඉදිරි අභ්‍යන්තර ප්‍රාථමිකය (FIP) F1c සහ F2 වලින් සමන්විත වේ.

පසුගාමී අභ්‍යන්තර ප්‍රාථමිකය (BIP) B1c සහ B2 වලින් සමන්විත වන අතර TTTT මධ්‍යයේ පරතරයක් ලෙස භාවිතා කරයි.

පිටත ප්‍රාථමික F3 සහ B3 ඉලක්කගත ජානය මත පිළිවෙළින් F3 සහ B3 කලාප වලින් සමන්විත වේ.

LAMP ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියේ අභ්‍යන්තර ප්‍රාථමිකයේ සාන්ද්‍රණය පිටත ප්‍රාථමිකයේ සාන්ද්‍රණය මෙන් කිහිප ගුණයකි.ඩීඑන්ඒ ද්විත්ව නූල් සෑදීම සඳහා අනුපූරක නූල් සංස්ලේෂණය කිරීම සඳහා අභ්‍යන්තර ප්‍රාථමිකය ප්‍රථමයෙන් අච්චු පොට සමඟ ඒකාබද්ධ කෙරේ.පසුව, පිටත ප්‍රාථමිකය සැකිලි පොට සමඟ ඒකාබද්ධ කර DNA ද්විත්ව නූල් සාදයි.BstDNA පොලිමරේස් ක්‍රියාව යටතේ, අභ්‍යන්තර ප්‍රාථමිකය මගින් සංස්ලේෂණය කරන ලද අනුපූරක නූල් මුදා හරිනු ලැබේ.ප්‍රතික්‍රියා මාලාවකින් පසුව, අනුපූරක පොට අවසානයේ ගොළුබෙල්ල ව්‍යුහයක් සහිත තනි DNA පොටක් සාදයි.

විවෘත කෙළවරක් සහිත සංක්‍රාන්ති කඳ-ලූප් ව්‍යුහයක් DNA අඛණ්ඩව සෑදීම සඳහා ඩම්බල් ව්‍යුහය DNA තනි කෙඳිම අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරයි.අභ්‍යන්තර සහ පිටත ප්‍රයිමර් මගින් සංක්‍රාන්ති කඳ-ලූප් ව්‍යුහය DNA අඛණ්ඩව නූල් විස්ථාපන සහ විස්තාරණ ප්‍රතික්‍රියා වලට භාජනය වන අතර අවසානයේ විවිධ දිග සහිත බහු කඳ-ලූප ව්‍යුහයන් සාදයි.DNA මිශ්රණය.

ලූප්-මැදිහත් වූ සමෝෂ්ණ විස්තාරණයේ වාසි සහ අවාසි

LAMP හි වාසි:

(1) පැය 1ක් ඇතුළත ඉලක්කගත ජානයේ පිටපත් 1-10ක් ඵලදායි ලෙස විස්තාරණය කළ හැකි ඉහළ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව, සහ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සාමාන්‍ය PCR මෙන් 10-100 ගුණයක් වේ.

(2) ප්‍රතික්‍රියා කාලය කෙටි වේ, විශේෂත්වය ශක්තිමත් වන අතර විශේෂ උපකරණ අවශ්‍ය නොවේ.

LAMP හි අඩුපාඩු:

(1) ප්‍රයිමර් සඳහා අවශ්‍යතා විශේෂයෙන් ඉහළ ය.

(2) විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදනය ක්ලෝනීකරණය සහ අනුක්‍රමණය සඳහා භාවිතා කළ නොහැක, නමුත් විනිශ්චය සඳහා පමණක් භාවිතා කළ හැක.

(3) එහි ප්‍රබල සංවේදිතාව හේතුවෙන්, එය aerosol සෑදීමට පහසු වන අතර, ව්‍යාජ ධනාත්මක කරුණු ඇති කර පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලවලට බලපායි.

Sවෙළඳ විස්ථාපන විස්තාරණය

ස්ට්‍රෑන්ඩ් ඩිස්ප්ලේස්මන්ට් ඇම්ප්ලිෆිකේෂන් (එස්ඩීඒ) යනු 1992 දී ඇමරිකානු විශාරද වෝකර් විසින් ප්‍රථම වරට යෝජනා කරන ලද එන්සයිම ප්‍රතික්‍රියාව මත පදනම් වූ අභ්‍යන්තර සමෝෂ්ණ ඩීඑන්ඒ විස්තාරණ තාක්‍ෂණයකි.

SDA හි මූලික පද්ධතියට සීමා කිරීම් එන්ඩොනියුක්ලීස්, නූල් විස්ථාපන ක්‍රියාකාරකම් සහිත DNA පොලිමරේස්, ප්‍රයිමර් යුගල දෙකක්, dNTPs සහ කැල්සියම් සහ මැග්නීසියම් අයන සහ බෆර පද්ධති ඇතුළත් වේ.

නූල් විස්ථාපන විස්තාරණය කිරීමේ මූලධර්මය පදනම් වී ඇත්තේ ඉලක්කගත DNA වල දෙපසම රසායනිකව වෙනස් කරන ලද සීමා කිරීම් endonuclease හඳුනාගැනීමේ අනුපිළිවෙල මතය.එන්ඩොනියුක්ලීස් එහි හඳුනාගැනීමේ ස්ථානයේ දී ස්ට්‍රැන්ඩ් DNA හි පරතරය විවෘත කරයි, සහ DNA පොලිමරේස් පරතරය 3′ අන්තය දිගු කර ඊළඟ DNA නූල් ප්‍රතිස්ථාපනය කරයි.

ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලද DNA වල තනි කෙඳි ප්‍රයිමර් සමඟ ඒකාබද්ධ කළ හැකි අතර DNA පොලිමරේස් මගින් ද්විත්ව කෙඳි දක්වා දිගු කළ හැක.මෙම ක්‍රියාවලිය අඛණ්ඩව පුනරාවර්තනය වන අතර එමඟින් ඉලක්ක අනුපිළිවෙල කාර්යක්ෂමව විස්තාරණය වේ.

නූල් විස්ථාපන විස්තාරණ තාක්ෂණයේ වාසි සහ අවාසි

SDA හි වාසි:

විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව ඉහළයි, ප්රතික්රියා කාලය කෙටි වේ, විශේෂත්වය ශක්තිමත් වන අතර විශේෂ උපකරණ අවශ්ය නොවේ.

SDA හි අඩුපාඩු:

නිෂ්පාදන ඒකාකාරී නොවන අතර සමහර තනි නූල් සහ ද්විත්ව නූල් නිෂ්පාදන සෑම විටම SDA චක්‍රය තුළ නිපදවන අතර ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් මගින් අනාවරණය කරගත් විට වලිගය අනිවාර්යයෙන්ම සිදුවනු ඇත.

Rඔලිං කව විස්තාරණය

රෝලිං කව විස්තාරණය (ආර්සීඒ) යෝජනා කරනුයේ රෝලිං කවය මගින් ව්‍යාධිජනක ජීවීන්ගෙන් DNA පිටපත් කිරීමේ ක්‍රමය ඇඳීමෙනි.එය ඉලක්කගත ජානයේ විස්තාරණය සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා රෝලිං කවය DNA සංස්ලේෂණයේ ක්‍රියාව යටතේ නියත උෂ්ණත්වයකදී සැකිල්ලක් ලෙස තනි කෙඳි සහිත වෘත්තාකාර DNA භාවිතා කිරීම සහ විශේෂ DNA පොලිමරේස් (Phi29 වැනි) භාවිතා කරයි.

RCA රේඛීය විස්තාරණය සහ ඝාතීය විස්තාරණය ලෙස බෙදිය හැකිය.රේඛීය RCA හි කාර්යක්ෂමතාව 10 දක්වා ළඟා විය හැකිය⁵වාර, සහ ඝාතීය RCA හි කාර්යක්ෂමතාව 10 දක්වා ළඟා විය හැක⁹වාර.

සරල වෙනස, පහත රූපයේ පෙන්වා ඇති පරිදි, රේඛීය විස්තාරණය a ප්‍රාථමික 1 ක් පමණක් භාවිතා කරයි, ඝාතීය විස්තාරණය b ප්‍රාථමික 2 ක් ඇත.

රේඛීය RCA තනි ප්‍රයිමර් RCA ලෙසද හැඳින්වේ.ප්‍රාථමිකයක් වෘත්තාකාර DNA වලට බන්ධනය වන අතර DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාවෙන් දිගු වේ.නිෂ්පාදිතය තනි පුඩුවක දිග මෙන් දහස් ගුණයකින් පුනරාවර්තන අනුපිළිවෙලවල් විශාල සංඛ්‍යාවක් සහිත රේඛීය තනි කෙඳියකි.

රේඛීය RCA හි නිෂ්පාදිතය සෑම විටම ආරම්භක ප්‍රාථමිකයට සම්බන්ධ වන බැවින්, සංඥාව පහසුවෙන් සවි කිරීම ප්‍රධාන වාසියකි.

ඝාතීය RCA, Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA) ලෙසද හැඳින්වේ, ඝාතීය RCA හි එක් ප්‍රාථමිකයක් RCA නිෂ්පාදනය විස්තාරණය කරයි, දෙවන ප්‍රාථමිකය RCA නිෂ්පාදනය සමඟ දෙමුහුන් වී දිගු කරයි, සහ ප්‍රතිස්ථාපනය දැනටමත් RCA නිෂ්පාදනයට බැඳී ඇත, RCA නිෂ්පාදනයට ප්‍රතිස්ථාපනය දැනටමත් බැඳී ඇත.

රෝලිං කවය න්‍යෂ්ටික අම්ල විස්තාරණය කිරීමේ වාසි සහ අවාසි

RCA හි වාසි:

ඉහළ සංවේදීතාව, හොඳ නිශ්චිතභාවය සහ පහසු මෙහෙයුම්.

RCA හි අඩුපාඩු:

සංඥා හඳුනාගැනීමේදී පසුබිම් ගැටළු.RCA ප්‍රතික්‍රියාව අතරතුර, සංසරණ නොවන අගුළු පරීක්‍ෂණය සහ නොබැඳි පරීක්‍ෂණයේ අච්චු DNA හෝ RNA සමහර පසුබිම් සංඥා ජනනය කළ හැකිය. 

Nucleicacid අනුපිළිවෙල පදනම් වූ විස්තාරණය

න්‍යෂ්ටික අම්ල අනුක්‍රමය පදනම් කරගත් විස්තාරණය (NASBA) යනු PCR පදනම මත සංවර්ධනය කරන ලද නව තාක්‍ෂණයකි.එය T7 ප්‍රවර්ධක අනුපිළිවෙලක් සහිත ප්‍රයිමර් යුගලයක් මගින් මෙහෙයවනු ලබන අඛණ්ඩ සහ සමෝෂ්ණ න්‍යෂ්ටික අම්ල විස්තාරණයකි.තාක්‍ෂණයට පැය 2ක පමණ කාලයකදී RNA අච්චුව 109 ගුණයකින් පමණ විස්තාරණය කළ හැකි අතර එය සාමාන්‍ය PCR ක්‍රමයට වඩා 1000 ගුණයකින් වැඩි වන අතර විශේෂ උපකරණ අවශ්‍ය නොවේ.

රෝග ඇති වූ විගස ඉක්මන් රෝග විනිශ්චය සඳහා මෙම තාක්ෂණය භාවිතා කර ඇති අතර බොහෝ සමාගම් දැනට RNA හඳුනාගැනීමේ කට්ටලවල මෙම ක්‍රමය භාවිතා කරයි.

RNA වර්ධකයට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ PCR තාක්ෂණය ද භාවිතා කළ හැකි වුවද, NASBA හට එහිම වාසි ඇත: එය සාපේක්ෂ නියත උෂ්ණත්ව තත්ත්ව යටතේ සිදු කළ හැකි අතර, එය සම්ප්‍රදායික PCR තාක්ෂණයට වඩා ස්ථායී සහ නිවැරදි වේ.

ප්‍රතික්‍රියාව සෙල්සියස් අංශක 41ක වන අතර සම්පූර්ණ කිරීමට AMV (avian myeloblastosis වෛරසය) ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස්, RNase H, T7 RNA පොලිමරේස් සහ ප්‍රයිමර් යුගලයක් අවශ්‍ය වේ.

ක්රියාවලිය ප්රධාන වශයෙන් ඇතුළත් වේ:

ඉදිරි ප්‍රාථමිකයේ T7 ප්‍රවර්ධකයේ අනුපූරක අනුපිළිවෙල අඩංගු වේ.ප්‍රතික්‍රියාව අතරතුර, ඉදිරි ප්‍රාථමිකය RNA තන්තුවට බැඳී AMV එන්සයිම මගින් උත්ප්‍රේරණය කර DNA-RNA ද්විත්ව නූල් සාදයි.

RNase H දෙමුහුන් ද්විත්ව නූල් වල RNA දිරවන අතර තනි නූල් DNA රඳවා ගනී.

ප්‍රතිලෝම ප්‍රාථමිකයේ සහ AMV එන්සයිමයේ ක්‍රියාකාරිත්වය යටතේ, T7 ප්‍රවර්ධක අනුක්‍රමය අඩංගු DNA ද්විත්ව නූල් සෑදී ඇත.

T7 RNA පොලිමරේස් ක්‍රියාව යටතේ, පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය අවසන් වන අතර ඉලක්කගත RNA විශාල ප්‍රමාණයක් නිපදවනු ලැබේ.

NASBA හි වාසි:

(1) එහි ප්‍රාථමිකයේ T7 ප්‍රවර්ධක අනුපිළිවෙලක් ඇත, නමුත් විදේශීය ද්විත්ව නූල් DNA හට T7 ප්‍රවර්ධක අනුපිළිවෙලක් නොමැති අතර විස්තාරණය කළ නොහැක, එබැවින් මෙම තාක්ෂණයට ඉහළ නිශ්චිතතාවයක් සහ සංවේදීතාවයක් ඇත.

(2) NASBA සෘජුවම විස්තාරණ ප්‍රතික්‍රියාවට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය ඇතුළත් කරයි, ප්‍රතික්‍රියා කාලය කෙටි කරයි.

NASBA හි අවාසි:

(1) ප්රතික්රියා සංරචක වඩාත් සංකීර්ණ වේ.

(2) ප්‍රතික්‍රියා පිරිවැය වැඩි කිරීමට එන්සයිම වර්ග තුනක් අවශ්‍ය වේ.