රසායනාගාරයේ නව එකක් ලෙස, අඩු පරිවර්තන අනුපාතයක් ඇති ශාක සමූහයකින් ධනාත්මක ශාක පරීක්ෂා කිරීම හොඳ කාර්යයක් නොවේ.පළමුව, DNA සාම්පල විශාල සංඛ්‍යාවකින් එකින් එක නිස්සාරණය කළ යුතු අතර, පසුව PCR මගින් විදේශීය ජාන අනාවරණය කරනු ලැබේ.කෙසේ වෙතත්, ප්රතිඵල බොහෝ විට හිස් සහ වරින් වර අයිතම කිහිපයක් සහිත තීරු වේ, නමුත් මඟ හැරුණු හඳුනාගැනීම් තිබේද නැතහොත් ව්‍යාජ හඳුනාගැනීම් තිබේද යන්න තීරණය කළ නොහැක..එවැනි පර්යේෂණාත්මක ක්‍රියාවලියකට සහ ප්‍රතිඵලවලට මුහුණ දීම ඉතා අසරණද?කණගාටු නොවන්න, සංක්‍රාන්ති ධනාත්මක ශාක පහසුවෙන් සහ නිවැරදිව පරික්ෂා කරන ආකාරය සහෝදරයා ඔබට උගන්වයි.
පියවර 1
සැලසුම් හඳුනාගැනීමේ ප්‍රයිමර්
පරීක්ෂා කිරීමට නියමිත නියැදියට අනුව හඳුනාගත යුතු අන්තරාසර්ග ජාන සහ බාහිර ජාන නිර්ණය කර, ප්‍රාථමික නිර්මාණය සඳහා ජානයේ නියෝජිත 100-500bp අනුපිළිවෙලක් තෝරන්න.හොඳ ප්‍රයිමර් මඟින් හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිඵලවල නිරවද්‍යතාව සහතික කළ හැකි අතර හඳුනාගැනීමේ කාලය කෙටි කළ හැක (සාමාන්‍යයෙන් භාවිත වන හඳුනාගැනීමේ ප්‍රාථමික සඳහා උපග්‍රන්ථය බලන්න).
දැනුම්දීම: අලුතින් නිර්මාණය කරන ලද ප්‍රයිමර්වලට ප්රතික්රියා තත්ත්වයන් ප්‍රශස්ත කිරීමටත්, මහා පරිමාණ අනාවරණයට පෙර අනාවරණයේ නිරවද්‍යතාව, නිරවද්‍යතාව සහ හඳුනාගැනීමේ සීමාව සත්‍යාපනය කිරීමටත් අවශ්ය වේ.
පියවර 2
පර්යේෂණාත්මක ප්‍රොටෝකෝලය සැලසුම් කරන්න
ධනාත්මක පාලනය: PCR ප්රතික්රියා පද්ධතිය සහ තත්වයන් සාමාන්‍යද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා සැකිල්ලක් ලෙස ඉලක්ක ඛණ්ඩය අඩංගු පිරිසිදු කරන ලද DNA භාවිතා කරන්න.
සෘණ/හිස් පාලනය: PCR පද්ධතියේ අපවිත්‍ර වීමේ ප්‍රභවයක් තිබේද යන්න සොයා ගැනීමට අච්චුවක් ලෙස ඉලක්ක කොටස අඩංගු නොවන DNA අච්චුව හෝ ddH2O භාවිතා කරන්න.
අභ්‍යන්තර විමර්ශන පාලනය: PCR මගින් අච්චුව අනාවරණය කර ගත හැකිද යන්න ඇගයීමට පරීක්ෂා කිරීමට නියැදියේ ආවේණික ජානයේ ප්‍රාථමික/පරීක්ෂණ සංයෝජනය භාවිතා කරන්න.
දැනුම්දීම:
පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵලවල වලංගුභාවය ඇගයීම සඳහා එක් එක් පරීක්ෂණය සඳහා ධනාත්මක, සෘණ/හිස් පාලන සහ අභ්‍යන්තර පාලන පාලන සැකසිය යුතුය.
අත්හදා බැලීම් සකස් කිරීම
භාවිතයට පෙර, විසඳුම ඒකාකාරව මිශ්ර වී ඇත්දැයි නිරීක්ෂණය කරන්න.වර්ෂාපතනයක් සොයාගතහොත්, භාවිතයට පෙර උපදෙස් අනුව එය විසුරුවා හැර මිශ්ර කිරීම අවශ්ය වේ.2×PCR මිශ්‍රණය අසමාන අයන ව්‍යාප්තිය වළක්වා ගැනීම සඳහා භාවිතයට පෙර නැවත නැවතත් මයික්‍රොපයිපෙට් සමඟ මිශ්ර කළ යුතුය.
දැනුම්දීම:
අත්පොත පිටතට ගෙන එය ප්රවේශමෙන් කියවා, අත්පොතෙහි අවශ්යතා සමග දැඩි ලෙස අනුකූලව අත්හදා බැලීමට පෙර සූදානම් කරන්න.
පියවර 4
PCR ප්රතික්රියා පද්ධතිය සකස් කරන්න
පර්යේෂණාත්මක ප්‍රොටෝකෝලය අනුව, ප්‍රයිමර්, H2O සහ 2×PCR මිශ්‍රණය ඒකාකාරව මිශ්ර කර, කේන්ද්‍රාපසාරී කර ඒවා එක් එක් ප්රතික්රියා නලයට බෙදා හරින්න.
දැනුම්දීම:
මහා පරිමාණ හෝ දිගු කාලීන පරීක්ෂණ සඳහා, PCR නිෂ්පාදන මගින් ඇතිවන aerosol දූෂණය ඵලදායී ලෙස වළක්වා ගත හැකි UNG එන්සයිම අඩංගු PCR ප්රතික්රියා පද්ධතියක් භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.
පියවර 5
ප්රතික්රියා අච්චුව එක් කරන්න
සෘජු PCR තාක්ෂණය භාවිතයෙන්, වෙහෙසකර න්යෂ්ටික අම්ල පිරිසිදු කිරීමේ ක්රියාවලියක් අවශ්ය නොවේ, නියැදි ආකෘතිය විනාඩි 10 ක් ඇතුළත සකස් කළ හැකි අතර, ඊට අනුරූප PCR ප්රතික්රියා පද්ධතිය එකතු කළ හැකිය.
දැනුම්දීම:
ක්ලීවේජ් ක්‍රමයට වඩා හොඳ හඳුනාගැනීමේ බලපෑමක් ඇති අතර, ලබාගත් නිෂ්පාදනය බහු හඳුනාගැනීමේ ප්රතික්රියා සඳහා භාවිතා කළ හැක.
5.1: කොළ සෘජු ප්රසාරණය
අත්පොතෙහි ඇති පින්තූරයේ විශාලත්වය අනුව, 2-3mm විෂ්කම්භයක් සහිත කොළ පටක කපා PCR ප්රතික්රියා පද්ධතියේ තබන්න.
සටහන: පත්‍ර කැබලි PCR ප්රතික්රියා ද්‍රාවණයේ සම්පූර්ණයෙන්ම ගිල්වා ඇති බව සහතික කර ගන්න, වැඩිපුර පත්‍ර පටක එකතු නොකරන්න.
5.2: පත්‍ර බෙදීමේ ක්රමය
5-7mm විෂ්කම්භයක් සහිත පත්‍ර පටක කපා එය කේන්ද්‍රාපසාරී නලයක තබන්න.ඔබ පරිණත කොළ තෝරා ගන්නේ නම්, කරුණාකර පත්‍රයේ ප්‍රධාන ශිරා පටක භාවිතා කිරීමෙන් වළකින්න.Pipette 50ul Buffer P1 කේන්ද්‍රාපසාරී නලයකට ලයිසේට් මගින් පත්‍ර පටක සම්පූර්ණයෙන්ම ගිල්වා තාප චක්‍රයක හෝ ලෝහ ස්නානයක තබා විනාඩි 5-10ක් 95°C ට ලයිස් කළ හැක.
50ul Buffer P2 උදාසීන විසඳුම එකතු කර හොඳින් මිශ්ර කරන්න.එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස ලයිසේට් සැකිල්ලක් ලෙස භාවිතා කළ හැකි අතර PCR ප්රතික්රියා පද්ධතියට එකතු කළ හැක.
සටහන: අච්චුවේ ප්‍රමාණය PCR පද්ධතියේ 5-10% අතර වන අතර, 20% නොඉක්මවිය යුතුය (උදාහරණයක් ලෙස, 20μl PCR පද්ධතියක, 1-2μl ලයිසිස් ද්‍රාවණයක් එක් කරන්න, 4μl ට වඩා වැඩි නොවේ).
පියවර 6
PCR ප්රතික්රියාව
PCR ප්රතික්රියා නළය කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීමෙන් පසුව, එය විස්තාරණය සඳහා PCR උපකරණයක තබා ඇත.
දැනුම්දීම:
ප්රතික්රියාව විස්තාරණය සඳහා පිරිසිදු නොකළ අච්චුවක් භාවිතා කරයි, එබැවින් වර්ධක චක්‍ර සංඛ්‍යාව පිරිසිදු කළ DNA අච්චුව භාවිතා කරන විට වඩා චක්‍ර 5-10 ක් වැඩි වේ.
පියවර 7
විද්යුත් විච්ඡේදනය හඳුනා ගැනීම සහ ප්රතිඵල විශ්ලේෂණය
M: 100bp DNA ඉණිමඟ
1\4: පවිත්‍ර DNA ක්රමය
2\5: සෘජු PCR ක්රමය
3\6: හිස් පාලනය
QC:
අත්හදා බැලීමේදී සකසා ඇති විවිධ පාලනවල පරීක්ෂණ ප්රතිඵල පහත කොන්දේසි සපුරාලිය යුතුය.එසේ නොමැති නම්, ගැටලුවේ හේතුව විශ්ලේෂණය කළ යුතු අතර, ගැටලුව ඉවත් කිරීමෙන් පසුව නැවත පරීක්ෂණය සිදු කළ යුතුය.
වගුව 1. විවිධ පාලන කණ්ඩායම්වල සාමාන්ය පරීක්ෂණ ප්රතිඵල
*ප්ලාස්මිඩය ධනාත්මක පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන විට, ආවේණික ජාන පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලය සෘණාත්මක විය හැක
ප්රතිඵල විනිශ්චය:
A. නියැදියේ ආවේණික ජානයේ පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලය සෘණාත්මක වන අතර, සාමාන්ය PCR හඳුනාගැනීම සඳහා සුදුසු DNA සාම්පලයෙන් ලබා ගත නොහැකි බව හෝ නිස්සාරණය කරන ලද DNA වල PCR ප්රතික්රියා නිෂේධක අඩංගු වන අතර DNA නැවත නිස්සාරණය කළ යුතු බව පෙන්නුම් කරයි.
B. නියැදියේ ආවේණික ජානයේ පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලය ධනාත්මක වන අතර බාහිර ජානයේ පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලය ඍණාත්මක වන අතර සාමාන්ය PCR හඳුනාගැනීම සඳහා සුදුසු DNA සාම්පලයෙන් උපුටා ගන්නා බව පෙන්නුම් කරන අතර නියැදිය තුළ XXX ජානය අනාවරණය වී නොමැති බව විනිශ්චය කළ හැකිය.
C. නියැදියේ අන්තරාසර්ග ජානයේ පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලය ධනාත්මක වන අතර බාහිර ජානයේ පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලය ධනාත්මක වන අතර සාමාන්ය PCR හඳුනාගැනීම සඳහා සුදුසු DNA සාම්පලයෙන් උපුටාගෙන ඇති බව පෙන්නුම් කරන අතර DNA වල XXX ජානය අඩංගු වේ.තහවුරු කිරීමේ අත්හදා බැලීම් තවදුරටත් සිදු කළ හැකිය.
පියවර 8
සැලසුම් හඳුනාගැනීමේ ප්‍රයිමර්
පරීක්ෂණයෙන් පසු, පරිසර දූෂණය වැළැක්වීම සඳහා පර්යේෂණාත්මක ප්රදේශය පිසදැමීමට 2% සෝඩියම් හයිපොක්ලෝරයිට් ද්රාවණය සහ 70% එතනෝල් ද්රාවණය භාවිතා කරන්න.
පසු කාලය: සැප්-08-2021
