ආරම්භක ද්රව්ය: RNA
ප්‍රමාණාත්මක ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ PCR (RT-qPCR) යනු PCR පරීක්ෂණවලදී RNA ආරම්භක ද්රව්ය ලෙස භාවිතා කරන පර්යේෂණාත්මක ක්‍රමයකි.මෙම ක්‍රමයේදී, සම්පූර්ණ RNA හෝ පණිවිඩකරු RNA (mRNA) ප්‍රථමයෙන් ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම මගින් අනුපූරක DNA (cDNA) බවට පිටපත් කරනු ලැබේ.පසුව, cDNA සැකිල්ලක් ලෙස භාවිතා කරමින් qPCR ප්‍රතික්‍රියාවක් සිදු කරන ලදී.RT-qPCR ජාන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය, RNA මැදිහත්වීම් වලංගු කිරීම, ක්ෂුද්‍ර අරා වලංගු කිරීම, රෝග කාරක හඳුනාගැනීම, ජාන පරීක්ෂාව සහ රෝග පර්යේෂණ ඇතුළු විවිධ අණුක ජීව විද්‍යා යෙදුම්වල භාවිතා කර ඇත.
RT-qPCR සඳහා එක්-පියවර සහ ද්වි-පියවර ක්රම
RT-qPCR එක්-පියවරක් හෝ ද්වි-පියවර ක්රමයක් මගින් ඉටු කළ හැක.එක්-පියවර RT-qPCR ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ PCR විස්තාරණය ඒකාබද්ධ කරයි, ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් සහ ඩීඑන්ඒ පොලිමරේස් එකම බෆර තත්ව යටතේ එකම නලයක ප්‍රතික්‍රියාව සම්පූර්ණ කිරීමට ඉඩ සලසයි.එක්-පියවර RT-qPCR සඳහා අවශ්‍ය වන්නේ අනුක්‍රමික-විශේෂිත ප්‍රයිමර් භාවිතා කිරීම පමණි.ද්වි-පියවර RT-qPCR හි, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ PCR විස්තාරණය විවිධ ප්‍රශස්ත බෆර, ප්‍රතික්‍රියා තත්ත්වයන් සහ ප්‍රාථමික සැලසුම් උපාය මාර්ග භාවිතා කරමින් නල දෙකකින් සිදු කෙරේ.
| වාසිය | අවාසිය | |
| එක් පියවරක් | මෙම ක්‍රමයට ප්‍රතික්‍රියා දෙකම එක නලයක සිදු කරන බැවින් අඩු පර්යේෂණාත්මක දෝෂයක් ඇත
අඩු පයිප්ප තැබීමේ පියවර දූෂණය වීමේ අවදානම අඩු කරයි
වේගවත් සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකි, අධි-ත්‍රිපුට් විස්තාරණය/screening සඳහා සුදුසු වේ | ද්වි-පියවර ප්‍රතික්‍රියා වෙන වෙනම ප්‍රශස්ත කළ නොහැක
ද්වි-පියවර ප්‍රතික්‍රියාව ඒකාබද්ධ කිරීමෙන් ප්‍රතික්‍රියා තත්ත්වයන් අවදානමට ලක්වන බැවින්, සංවේදිතාව පියවර දෙකේ ක්‍රමයේ තරම් හොඳ නැත.
එක් නියැදියකින් අනාවරණය කරගත් ඉලක්ක ගණන කුඩා වේ |
| පියවර දෙකක් | දිගු කාලයක් ගබඩා කළ හැකි සහ බහු ප්‍රතික්‍රියා සඳහා භාවිතා කළ හැකි ස්ථාවර cDNA පුස්තකාල නිර්මාණය කිරීමේ හැකියාව
බහු cDNA පුස්තකාල අවශ්‍යතාවයකින් තොරව එකම cDNA පුස්තකාලයෙන් ඉලක්ක ජාන සහ විමර්ශන ජාන විස්තාරණය කළ හැක.
තනි ප්‍රතික්‍රියා ධාවන ප්‍රශස්තකරණය සක්‍රීය කරන ප්‍රතික්‍රියා බෆර සහ ප්‍රතික්‍රියා කොන්දේසි
ප්‍රේරක කොන්දේසි නම්‍යශීලී තේරීම | බහුවිධ නල භාවිතා කිරීම සහ තවත් පයිප්ප තැබීමේ පියවර DNA දූෂණය වීමේ අවදානම වැඩි කරයි, සහ කාලය නාස්ති.
එක්-පියවර ක්‍රමයට වඩා වැඩි ප්‍රශස්තකරණයක් අවශ්‍ය වේ |
ආශ්රිත නිෂ්පාදන:
RT-qPCR පහසු (එක් පියවරක්)-SYBR හරිත I
RT-qPCR පහසු (එක් පියවරක්)-තක්මාන්
RT Easyᴹ I Master Premix for First-Strand CDNA සංශ්ලේෂණය
රියල් ටයිම් PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I කට්ටලය
සම්පූර්ණ RNA සහ mRNA තෝරාගැනීම
RT-qPCR අත්හදා බැලීමක් සැලසුම් කිරීමේදී, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා අච්චුවක් ලෙස සම්පූර්ණ RNA හෝ පිරිසිදු mRNA භාවිතා කරන්නේද යන්න තීරණය කිරීම වැදගත් වේ.mRNA වලට තරමක් ඉහළ සංවේදීතාවයක් ලබා දිය හැකි වුවද, සම්පූර්ණ RNA තවමත් නිතර භාවිතා වේ.මෙයට හේතුව mRNA වලට වඩා සම්පූර්ණ RNA වලට ආරම්භක ද්‍රව්‍යයක් ලෙස වැදගත් වාසියක් තිබීමයි.පළමුව, ක්‍රියාවලියට අඩු පිරිසිදු කිරීමේ පියවර අවශ්‍ය වේ, එමඟින් අච්චුවේ වඩා හොඳ ප්‍රමාණාත්මක ප්‍රතිසාධනය සහ සෛල අංක ආරම්භ කිරීමට ප්‍රතිඵල වඩා හොඳ සාමාන්‍යකරණය සහතික කරයි.දෙවනුව, එය විවිධ mRNA වල විවිධ ප්‍රතිසාධනය හේතුවෙන් විකෘති ප්‍රතිඵල ඇතිවීමේ හැකියාව වළක්වා ගත හැකි mRNA පොහොසත් කිරීමේ පියවර මග හරියි.සමස්තයක් වශයෙන්, බොහෝ යෙදුම්වල ඉලක්කගත ජානයේ සාපේක්ෂ ප්‍රමාණනය හඳුනාගැනීමේ නිරපේක්ෂ සංවේදීතාවට වඩා වැදගත් වන බැවින්, බොහෝ අවස්ථාවලදී සම්පූර්ණ RNA වඩාත් සුදුසු වේ.
ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රාථමිකය
ද්වි-පියවර ක්‍රමයේදී, cDNA ප්‍රතික්‍රියාව ප්‍රාථමික කිරීමට විවිධ ක්රම තුනක් භාවිතා කළ හැක: oligo(dT) ප්‍රයිමර්, සසම්භාවී ප්‍රයිමර්, හෝ අනුක්‍රමික-විශේෂිත ප්‍රයිමර්.සාමාන්‍යයෙන්, ඔලිගෝ(dT) ප්‍රයිමර් සහ සසම්භාවී ප්‍රයිමර් ඒකාබද්ධව භාවිතා වේ.මෙම ප්‍රාථමිකයන් mRNA තන්තුවට අනුවර්තනය වන අතර සංස්ලේෂණය සඳහා ආරම්භක ලක්ෂ්‍යයක් සමඟ ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම සපයයි.
| ප්‍රාථමික තේරීම | ව්යුහය සහ කාර්යය | වාසිය | අවාසිය |
| Oligo(dT) ප්‍රාථමිකය (හෝ නැංගුරම් ලා ඇති oligo(dT) ප්‍රාථමිකය) | mRNA වල පොලි(A) වලිගයේ ඇති තයිමින් අවශේෂ වලට විස්තීරණ ඇනීල් කිරීම;නැංගුරම් ඔලිගෝ(dT) ප්‍රාථමිකයේ 3′ අන්තයේ G, C, හෝ A අඩංගු වේ (නැංගුරම් අඩවිය) | බහු(A)-tailed mRNA වලින් පූර්ණ-දිග cDNA සංශ්ලේෂණය
අඩු ආරම්භක ද්රව්ය ලබා ගත හැකි විට අදාළ වේ
නැංගුරම් ස්ථානය ඔලිගෝ(dT) ප්‍රාථමිකය mRNA වල 5′ poly(A) වලිගයට බන්ධනය වන බව සහතික කරයි. | බහු(A) වලිග සහිත ජාන වර්ධක කිරීම සඳහා පමණක් සුදුසු වේ
පොලි(A) හි ප්‍රයිමිං අඩවිය*2 වෙතින් කැපූ cDNA ලබා ගන්න
3′ අන්තයට බැඳීමට පක්ෂග්‍රාහී*
*නැංගුරම් දැමූ ඔලිගෝ(dT) ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන්නේ නම් මෙම හැකියාව අවම වේ |
| අහඹු පාථමිකය
| 6 සිට 9 දක්වා දිග භෂ්ම, එය RNA පිටපත් කිරීමේදී ස්ථාන කිහිපයකට අනුවර්තනය විය හැක | සියලුම RNA වලට Anneal (tRNA, rRNA, සහ mRNA)
සැලකිය යුතු ද්විතියික ව්‍යුහයක් සහිත පිටපත් සඳහා හෝ අඩු ආරම්භක ද්රව්ය ලබා ගත හැකි විට සුදුසු වේ
ඉහළ cDNA අස්වැන්නක් | cDNA සියලුම RNA වලින් ප්රතිලෝම පිටපත් කර ඇත, එය සාමාන්‍යයෙන් අවශ්‍ය නොවන අතර ඉලක්කගත mRNA සංඥාව තනුක කළ හැක.
cDNA කප්පාදු කරන්න |
| අනුපිළිවෙල-විශේෂිත ප්‍රයිමර් | විශේෂිත mRNA අනුක්‍රමික ඉලක්ක කරන අභිරුචි ප්‍රයිමර් | විශේෂිත cDNA පුස්තකාලය
සංවේදීතාව වැඩි දියුණු කරන්න
ප්රතිලෝම qPCR ප්‍රයිමර් භාවිතා කිරීම | තනි ඉලක්ක ජානයක සංශ්ලේෂණයට පමණක් සීමා වේ |
ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම
Reverse transcriptase යනු DNA සංස්ලේෂණය කිරීමට RNA භාවිතා කරන එන්සයිමයකි.සමහර ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් වල RNase ක්‍රියාකාරකම් ඇති අතර පිටපත් කිරීමෙන් පසු RNA-DNA දෙමුහුන් නූල්වල RNA කෙඳි දිරාපත් කළ හැක.එහි RNase එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් නොමැති නම්, ඉහළ qPCR කාර්යක්ෂමතාව සඳහා RNaseH එකතු කළ හැක.බහුලව භාවිතා වන එන්සයිම අතරට Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase සහ Avian myeloblastoma virus reverse transcriptase ඇතුළත් වේ.RT-qPCR සඳහා, ඉහළ තාප ස්ථායීතාවයකින් යුත් ප්රතිලෝම පිටපතක් තෝරා ගැනීම වඩාත් සුදුසුය, එවිට cDNA සංස්ලේෂණය ඉහළ ද්විතියික ව්‍යුහයක් සහිත RNA වල සාර්ථක පිටපත් කිරීම සහතික කරමින්, ප්‍රතික්‍රියාව පුරාවටම ඒවායේ සම්පූර්ණ ක්‍රියාකාරිත්වය පවත්වා ගෙන යන අතරම, ඉහළ cDNA අස්වැන්නක් ලබා ගත හැක.
ආශ්රිත නිෂ්පාදන:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ RNase H ක්‍රියාකාරකම්
RNaseH හට RNA-DNA ඩුප්ලෙක්ස් වලින් RNA කෙඳි හායනය කිරීමට හැකි වන අතර, ද්විත්ව නූල් සහිත DNA කාර්යක්ෂමව සංශ්ලේෂණය කිරීමට ඉඩ සලසයි.කෙසේ වෙතත්, දිගු mRNA අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරන විට, RNA අකාලයේ දිරාපත් විය හැකි අතර, cDNA කපා හැරීමට හේතු විය හැක.එබැවින්, දිගු පිටපත්වල සංශ්ලේෂණය අවශ්‍ය නම් cDNA ක්ලෝනීකරණයේදී RNaseH ක්‍රියාකාරකම් අවම කිරීම බොහෝ විට ප්‍රයෝජනවත් වේ.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, RNase H ක්‍රියාකාරකම් සහිත ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම් qPCR යෙදුම් සඳහා බොහෝ විට ප්‍රයෝජනවත් වේ, මන්ද ඒවා PCR හි පළමු චක්‍රය තුළ RNA-DNA ඩුප්ලෙක්ස් දියවීම වැඩි දියුණු කරන බැවිනි.
ප්‍රයිමර් නිර්මාණය
RT-qPCR හි qPCR පියවර සඳහා භාවිතා කරන PCR ප්‍රයිමර් ඉතා මැනවින් නිර්මාණය කළ යුත්තේ එක්සෝන්-එක්සෝන් හන්දියක විහිදෙන පරිදි වන අතර, එහිදී විස්තාරණ ප්‍රාථමිකයකට සත්‍ය එක්සෝන්-ඉන්ට්‍රෝන සීමාවක් විහිදී යා හැකිය.අභ්‍යන්තර ප්‍රවේණි DNA අනුක්‍රම විස්තාරණය කර නොමැති බැවින්, මෙම සැලසුම ජානමය DNA දූෂිත වීමෙන් ව්‍යාජ ධනාත්මක වර්ධක අවදානම අඩු කරයි.
exons හෝ exon-exon මායිම් වෙන් කිරීමට ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කළ නොහැකි නම්, ජානමය DNA දූෂණය ඉවත් කිරීම සඳහා RNA සාම්පල RNase-free DNase I හෝ dsDNase සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීම අවශ්‍ය විය හැකිය.
RT-qPCR පාලනය
DNA දූෂණය (පෙර ප්‍රතික්‍රියා වලින් ප්‍රවේණික DNA හෝ PCR නිෂ්පාදන වැනි) හඳුනා ගැනීම සඳහා සියලුම RT-qPCR පරීක්ෂණ සඳහා ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ සෘණ පාලනයක් (-RT පාලනය) ඇතුළත් කළ යුතුය.මෙම පාලනයේ ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් හැර සියලුම ප්‍රතික්‍රියා සංරචක අඩංගු වේ.මෙම පාලනය සමඟ ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම සිදු නොවන බැවින්, PCR විස්තාරණය නිරීක්ෂණය කළහොත්, DNA වලින් දූෂණය වීමට බොහෝ දුරට ඉඩ ඇත.
පසු කාලය: අගෝස්තු-02-2022
