Ct අගය යනු ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR හි වඩාත් වැදගත් ප්‍රතිඵල ඉදිරිපත් කිරීමේ ආකාරයයි.එය ජාන ප්‍රකාශන වෙනස්කම් හෝ ජාන පිටපත් අංකය ගණනය කිරීමට භාවිතා කරයි.එසේ නම් සාධාරණ ලෙස සැලකෙන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණකරණයේ Ct අගය කුමක්ද?Ct අගයෙහි ඵලදායී පරාසය සහතික කරන්නේ කෙසේද?
Ct අගය යනු කුමක්ද?
qPCR විස්තාරණ ක්‍රියාවලියේදී, විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදනයේ ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව නියමිත ප්‍රතිදීප්ත සීමාවට ළඟා වන විට අනුරූප විස්තාරණ චක්‍ර ගණන (චක්‍ර සීමාව).C යනු Cycle සහ T යනු Threshold යන්නයි.සරලව කිවහොත්, Ct අගය යනු ආරම්භක අච්චු විස්තාරණය qPCR හි නිශ්චිත නිෂ්පාදන ප්‍රමාණයකට ළඟා වන විට අනුරූප වන චක්‍ර ගණනයි.ඊනියා "නිෂ්පාදන නිශ්චිත ප්රමාණයක්" පසුව තවදුරටත් පැහැදිලි කරනු ඇත.
Ct අගය කරන්නේ කුමක්ද?
1. ඝාතීය විස්තාරණය, අච්චු ප්‍රමාණය සහ Ct අගය අතර සම්බන්ධතාවය
ඉතා මැනවින්, qPCR හි ජාන නිශ්චිත චක්‍ර ගණනකට පසුව ඝාතීය විස්තාරණය මගින් එකතු වේ.විස්තාරණ චක්‍ර ගණන සහ නිෂ්පාදන ප්‍රමාණය අතර සම්බන්ධය වන්නේ: විස්තාරණය කළ නිෂ්පාදන ප්‍රමාණය = ආරම්භක අච්චු ප්‍රමාණය × (1+En) චක්‍ර අංකය.කෙසේ වෙතත්, qPCR ප්‍රතික්‍රියාව සෑම විටම පරමාදර්ශී තත්වයක නොමැත.විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදනයේ ප්‍රමාණය “නිශ්චිත නිෂ්පාදන ප්‍රමාණයකට” ළඟා වන විට, මෙම අවස්ථාවේදී චක්‍ර ගණන Ct අගය වන අතර එය ඝාතීය විස්තාරණ කාල සීමාව තුළ වේ.Ct අගය සහ ආරම්භක අච්චුවේ ප්‍රමාණය අතර සම්බන්ධය: සැකිල්ලේ Ct අගය සහ අච්චුවේ ආරම්භක පිටපත් අංකයේ ලඝුගණකය අතර රේඛීය සම්බන්ධතාවයක් ඇත.ආරම්භක අච්චු සාන්ද්‍රණය වැඩි වන තරමට Ct අගය කුඩා වේ;ආරම්භක අච්චු සාන්ද්‍රණය අඩු වන තරමට Ct අගය විශාල වේ.
2. විස්තාරණ වක්රය, ප්‍රතිදීප්ත එළිපත්ත සහ නිශ්චිත PCR නිෂ්පාදන ප්‍රමාණය
qPCR විස්තාරණ නිෂ්පාදනයේ ප්‍රමාණය ප්‍රතිදීප්ත සංඥා ස්වරූපයෙන් සෘජුවම ඉදිරිපත් කෙරේ, එනම් විස්තාරණ වක්රය.PCR හි මුල් අවධියේදී, විස්තාරණය පරිපූර්ණ තත්වයන් යටතේ පවතී, චක්‍ර ගණන කුඩා වේ, නිෂ්පාදන සමුච්චය කුඩා වන අතර ප්‍රතිදීප්තියේ මට්ටම ප්‍රතිදීප්ත පසුබිමෙන් පැහැදිලිව වෙන්කර හඳුනාගත නොහැක.ඊට පසු, ප්රතිදීප්තතාව වැඩි වන අතර ඝාතීය අවධියට ඇතුල් වේ.PCR ප්‍රතික්‍රියාව හුදෙක් ඝාතීය අවධියේ පවතින විට PCR නිෂ්පාදනයේ ප්‍රමාණය නිශ්චිත අවස්ථාවක අනාවරණය කර ගත හැකි අතර, එය "නිෂ්පාදනයේ නිශ්චිත ප්රමාණයක්" ලෙස භාවිතා කළ හැකි අතර, සැකිල්ලේ මූලික අන්තර්ගතය මෙයින් නිගමන කළ හැක.එබැවින්, යම් නිෂ්පාදන ප්‍රමාණයකට අනුරූප වන ප්‍රතිදීප්ත සංඥා තීව්‍රතාවය ප්‍රතිදීප්ත සීමාව වේ.
PCR හි අවසාන අදියරේදී, විස්තාරණ වක්රය තවදුරටත් ඝාතීය විස්තාරණය නොපෙන්වන අතර රේඛීය අවධිය සහ සානුව අවධියට ඇතුල් වේ.
3.Ct අගයන් ප්රතිනිෂ්පාදනය කිරීමේ හැකියාව
PCR චක්‍රය Ct අගයේ චක්‍ර අංකයට ළඟා වූ විට, එය සත්‍ය ඝාතීය විස්තාරණ කාල සීමාවට ඇතුළු වී ඇත.මෙම අවස්ථාවේදී, කුඩා දෝෂය විස්තාරණය කර නැත, එබැවින් Ct අගයෙහි ප්රතිනිෂ්පාදනය විශිෂ්ටයි, එනම්, එකම අච්චුව විවිධ කාලවලදී හෝ විවිධ නල වල එකවර විස්තාරණය කර ඇත.විස්තාරණය, ලබාගත් Ct අගය නියත වේ.
1. වර්ධක කාර්යක්ෂමතාව En
PCR වර්ධක කාර්යක්ෂමතාව යනු පොලිමරේස් ජානය ඇම්ප්ලිකන් බවට පරිවර්තනය කරන කාර්යක්ෂමතාවයි.එක් DNA අණුවක් DNA අණු දෙකක් බවට පරිවර්තනය වන විට විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 100% කි.වර්ධක කාර්යක්ෂමතාව සාමාන්‍යයෙන් En ලෙස ප්‍රකාශ වේ.පසුකාලීන ලිපි විශ්ලේෂණයට පහසුකම් සැලසීම සඳහා, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයට බලපාන සාධක කෙටියෙන් හඳුන්වා දෙනු ලැබේ.
| බලපාන සාධක | පැහැදිලි කිරීම | විනිශ්චය කරන්නේ කෙසේද? |
| A. PCR නිෂේධක | 1. DNA සැකිල්ලේ PCR ප්‍රතික්‍රියාව වළක්වන ද්‍රව්‍ය, එනම් ප්‍රෝටීන හෝ ඩිටර්ජන්ට් අඩංගු වේ.2. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමෙන් පසු cDNA තුළ අච්චු RNA හෝ RT ප්‍රතික්‍රියාකාරක සංරචකවල ඉහළ සාන්ද්‍රණයක් අඩංගු වන අතර, එය පසුකාලීන PCR ප්‍රතික්‍රියාව ද වළක්වයි. | 1. A260/A280 සහ A260/A230 හෝ RNA ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් අනුපාතය මැනීමෙන් දූෂණයක් තිබේද යන්න විනිශ්චය කළ හැක.2. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමෙන් පසු cDNA නිශ්චිත අනුපාතයකට අනුව තනුක කර තිබේද යන්න. |
| B. නුසුදුසු ප්‍රාථමික නිර්මාණය | ප්‍රයිමර් කාර්යක්ෂමව විවරණය නොවේ | ප්‍රයිමර්-ඩිමර් හෝ හිසකෙස්, නොගැලපීම් සහ සමහර විට අභ්‍යන්තර මෝස්තර සඳහා ප්‍රයිමර් පරීක්ෂා කරන්න. |
| C. නුසුදුසු PCR ප්රතික්රියා වැඩසටහන් නිර්මාණය | 1. ප්‍රයිමර් ඵලදායි ලෙස ඇනීල් කළ නොහැක2. DNA පොලිමරේස් ප්‍රමාණවත් ලෙස නිකුත් නොවීම 3. දිගුකාලීන ඉහළ උෂ්ණත්ව DNA පොලිමරේස් ක්රියාකාරිත්වය අඩු විය | 1. ප්‍රාථමිකයේ ටීඑම් අගයට වඩා ඇනීලිං උෂ්ණත්වය වැඩි වේ2. ප්‍රී-ඩීනාටරේෂන් කාලය ඉතා කුඩාය 3. ප්රතික්රියා ක්රියාපටිපාටියේ එක් එක් අදියරෙහි කාලය ඉතා දිගු වේ |
| D. ප්‍රතික්‍රියාකාරක මිශ්‍ර කිරීම ප්‍රමාණවත් නොවීම හෝ පයිප්ප තැබීමේ දෝෂ | ප්රතික්රියා පද්ධතිය තුළ, PCR ප්රතික්රියා සංරචකවල දේශීය සාන්ද්‍රණය ඉතා ඉහළ හෝ අසමාන වන අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස PCR විස්තාරණය ඝාතීය නොවන විස්තාරණය සිදුවේ. | |
| E. ඇම්ප්ලිකන් දිග | ඇම්ප්ලිකොනයේ දිග වැඩිය, 300bp ඉක්මවන අතර, වර්ධක කාර්යක්ෂමතාව අඩුය | ඇම්ප්ලිකන් දිග 80-300bp අතර වේදැයි පරීක්ෂා කරන්න |
| F. qPCR ප්රතික්රියාකාරකවල බලපෑම | ප්‍රතික්‍රියාකාරකයේ DNA පොලිමරේස් සාන්ද්‍රණය අඩු හෝ බෆරයේ අයන සාන්ද්‍රණය ප්‍රශස්ත නොවීම නිසා Taq එන්සයිම ක්රියාකාරිත්වය උපරිමයට නොපැමිණේ. | සම්මත වක්රය මගින් විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව නිර්ණය කිරීම |
2.Ct අගයන් පරාසය
Ct අගයන් 15-35 දක්වා පරාසයක පවතී.Ct අගය 15 ට වඩා අඩු නම්, විස්තාරණය මූලික කාල සීමාව තුළ පවතින අතර ප්‍රතිදීප්ත සීමාවට ළඟා වී නොමැති බව සලකනු ලැබේ.ඉතා මැනවින්, Ct අගය සහ අච්චුවේ ආරම්භක පිටපත් අංකයේ ලඝුගණකය අතර රේඛීය සම්බන්ධතාවයක් ඇත, එනම් සම්මත වක්රය.සම්මත වක්රය හරහා, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 100% වන විට, ජානයේ තනි පිටපත් අංකය ප්‍රමාණ කිරීම සඳහා ගණනය කරන ලද Ct අගය 35 ක් පමණ වේ. එය 35 ට වඩා වැඩි නම්, අච්චුවේ ආරම්භක පිටපත් අංකය න්‍යායාත්මකව 1 ට වඩා අඩු වන අතර එය අර්ථ විරහිත යැයි සැලකිය හැකිය.
විවිධ ජාන Ct පරාසයන් සඳහා, ජාන පිටපත් අංකයේ වෙනස සහ ආරම්භක අච්චු ප්‍රමාණයේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව හේතුවෙන්, ජානය සඳහා සම්මත වක්‍රයක් සාදා ජානයේ රේඛීය හඳුනාගැනීමේ පරාසය ගණනය කිරීම අවශ්‍ය වේ.
3.Ct අගය බලපාන සාධක
විස්තාරණ චක්‍ර සංඛ්‍යාව සහ නිෂ්පාදන ප්‍රමාණය අතර සම්බන්ධය අනුව: විස්තාරණය කළ නිෂ්පාදන ප්‍රමාණය = ආරම්භක අච්චු ප්‍රමාණය × (1+En) චක්‍ර අංකය, පරමාදර්ශී තත්ත්වයන් යටතේ, ආරම්භක අච්චුවේ ප්‍රමාණය සහ En ප්‍රමාණය Ct අගයට ඍණාත්මක බලපෑමක් ඇති කරන බව දැකිය හැකිය.අච්චුවේ ගුණාත්මක භාවයේ හෝ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයේ වෙනස Ct අගය ඉතා විශාල හෝ ඉතා කුඩා වීමට හේතු වේ.
4.Ct අගය ඉතා විශාල හෝ ඉතා කුඩා වේ
පසු කාලය: පෙබරවාරි-22-2023
