තත්‍ය කාලීන PCR, ප්‍රමාණාත්මක PCR හෝ qPCR ලෙසද හැඳින්වේ, PCR වර්ධක නිෂ්පාදන තත්‍ය කාලීන අධීක්ෂණය සහ විශ්ලේෂණය සඳහා වූ ක්‍රමයකි.
ප්‍රමාණාත්මක PCR සතුව සරල ක්‍රියාකාරිත්වය, වේගවත් සහ පහසු, ඉහළ සංවේදීතාව, හොඳ පුනරාවර්තන හැකියාව සහ අඩු දූෂණය වීමේ ප්‍රතිලාභ ඇති බැවින්, එය වෛද්‍ය පරීක්ෂණ, ඖෂධ කාර්යක්ෂමතාව තක්සේරු කිරීම, ජාන ප්‍රකාශන පර්යේෂණ, සංක්‍රාන්ති පර්යේෂණ, ජාන හඳුනාගැනීම, රෝග කාරක හඳුනාගැනීම්, සත්ව හා ශාක හඳුනාගැනීම සඳහා බහුලව භාවිතා වේ., ආහාර පරීක්ෂණ සහ වෙනත් ක්ෂේත්‍ර.
එබැවින්, ඔබ ජීව විද්‍යාව පිළිබඳ මූලික පර්යේෂණවල නියැලී සිටියත්, ඖෂධ සමාගම්වල, සත්ව පාලන සමාගම්වල, ආහාර සමාගම්වල හෝ ඇතුළුවීමේ පරීක්ෂණ සහ නිරෝධායන කාර්යාංශයේ, පාරිසරික අධීක්ෂණ දෙපාර්තමේන්තු, රෝහල් සහ වෙනත් ඒකකවල සේවකයින් වුවද, ඔබ අඩු වැඩි වශයෙන් නිරාවරණය වනු ඇත, නැතහොත් ප්‍රමාණාත්මක PCR ප්‍රගුණ කිරීමේ දැනුම ඔබ දැන සිටිය යුතුය.
රියල් ටයිම් PCR හි මූලධර්මය
Real Time PCR යනු PCR ප්රතික්රියා පද්ධතියට ප්රතිදීප්ත ද්‍රව්‍ය එකතු කරන ක්‍රමයක් වන අතර PCR ප්‍රතික්‍රියාවේ ක්‍රියාවලියේ ප්රතිදීප්ත සංඥා තීව්‍රතාවය ප්‍රමාණාත්මක PCR උපකරණයක් මගින් තත්‍ය කාලීනව නිරීක්ෂණය කරනු ලබන අතර අවසානයේ පර්යේෂණාත්මක දත්ත විශ්ලේෂණය කර සකස් කරනු ලැබේ.
【විස්තාරණ වක්රය】PCR හි ගතික ක්‍රියාවලිය විස්තර කරන වක්රය වේ.PCR හි විස්තාරණ වක්රය ඇත්ත වශයෙන්ම සම්මත ඝාතීය වක්‍රයක් නොව, සිග්මොයිඩ් වක්‍රයකි.
[විස්තාරණ වක්‍රයේ වේදිකා අදියර]PCR චක්‍ර ගණන වැඩිවීමත් සමඟ DNA පොලිමරේස් අක්‍රිය වීම, dNTPs සහ ප්‍රයිමර් ක්ෂය වීම සහ අතුරු නිෂ්පාදන පයිරොපොස්පේට් ප්‍රතික්‍රියාව මගින් සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාව නිෂේධනය කිරීම යනාදිය, PCR සෑම විටම ඝාතීය ලෙස ප්‍රසාරණය නොවේ., සහ අවසානයේ සානුවකට ඇතුල් වනු ඇත.
[විස්තාරණ වක්‍රයේ ඝාතීය වර්ධන කලාපය]සානුව අදියර විශාල වශයෙන් වෙනස් වුවද, විස්තාරණ වක්‍රයේ ඝාතීය වර්ධන කලාපයේ යම් කලාපයක, පුනරාවර්තන හැකියාව ඉතා හොඳයි, එය PCR හි ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය සඳහා ඉතා වැදගත් වේ.
[ඉදිරි අගය සහ Ct අගය]අපි විස්තාරණ වක්‍රයේ ඝාතීය වර්ධන ප්‍රදේශයේ සුදුසු ස්ථානයේ ප්රතිදීප්ත හඳුනාගැනීමේ සීමාව අගය සකසමු, එනම් එළිපත්ත අගය (ඉදිරිපත් වේ).එළිපත්ත අගය සහ විස්තාරණ වක්‍රයේ ඡේදනය යනු Ct අගයයි, එනම්, Ct අගය යනු එළිපත්ත අගයට ළඟා වූ විට චක්‍ර ගණන (Threshold Cycle) වේ.
පහත ප්‍රස්ථාරයෙන් එළිපත්ත රේඛාව සහ විස්තාරණ වක්රය, එළිපත්ත සහ Ct අගය අතර සම්බන්ධය පැහැදිලිව පෙන්වයි.
【ප්රමාණනය කරන්නේ කෙසේද?】
Ct අගය ආරම්භක සැකිලි සංඛ්‍යාවේ ලඝුගණකය සමඟ ප්‍රතිලෝම රේඛීය සම්බන්ධතාවයක් ඇති බව ගණිත න්‍යාය මගින් ඔප්පු කර ඇත.තත්‍ය කාලීන PCR PCR විස්තාරණ නිෂ්පාදන තත්‍ය කාලීනව නිරීක්ෂණය කරන අතර ඝාතීය විස්තාරණ අවධියේදී ඒවා ප්රමාණනය කරයි.
PCR හි සෑම චක්රයක් සඳහාම, DNA 2 ගුණයකින් ඝාතීය ලෙස වැඩි වූ අතර ඉක්මනින් සානුවකට ළඟා විය.
ආරම්භක DNA ප්‍රමාණය A වේ යැයි උපකල්පනය කරයි0 , n චක්‍රවලින් පසුව, DNA නිෂ්පාදනයේ න්‍යායාත්මක ප්‍රමාණය මෙසේ ප්‍රකාශ කළ හැක:
A n =A 0 × 2n
ඉන්පසුව, ආරම්භක DNA ප්‍රමාණය A 0 වැඩි වන තරමට, විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදනයේ ප්‍රමාණය හඳුනාගැනීමේ අගය An වෙත ළඟා වන අතර, An වෙත ළඟා වන විට චක්‍ර ගණන Ct අගය වේ.එනම්, ආරම්භක DNA ප්‍රමාණය A 0 වැඩි වන තරමට, වර්ධක වක්රය කලින් ඉහළ යන අතර, ඒ අනුව අවශ්ය චක්‍ර ගණන n කුඩා වේ.
අපි දන්නා සාන්ද්‍රණයේ ප්‍රමිතියේ අනුක්‍රමික තනුක කිරීම සිදු කරන අතර එය තත්‍ය කාලීන PCR සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරන අතර DNA ප්‍රමාණය වැඩි සිට අඩු දක්වා ආරම්භ කිරීමේ අනුපිළිවෙලට සමාන කාල පරතරයකින් විස්තාරණ වක්‍ර මාලාවක් ලබා ගනී.Ct අගය සහ ආරම්භක සැකිලි සංඛ්‍යාවේ ලඝුගණකය අතර රේඛීය සම්බන්ධතාවයට අනුව, a[සම්මත වක්රය] සෑදිය හැක.
නොදන්නා සාන්ද්‍රණය සහිත සාම්පලයේ Ct අගය සම්මත වක්‍රයට ආදේශ කිරීමෙන්, නොදන්නා සාන්ද්‍රණය සහිත නියැදියේ ආරම්භක අච්චු ප්‍රමාණය ලබා ගත හැක, එය Real Time PCR හි ප්‍රමාණාත්මක මූලධර්මයයි.
තත්‍ය කාලීන PCR හඳුනාගැනීමේ ක්රමය
Real Time PCR ප්රතික්රියා පද්ධතියේ ප්රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය හඳුනා ගැනීමෙන් PCR විස්තාරණ නිෂ්පාදන හඳුනා ගනී.
ප්රතිදීප්ත සායම් කාවැද්දීමේ ක්රමයේ මූලධර්මය】
ෆ්ෙලොරසන්ට් ඩයි වර්ග, TB Green ® වැනි, PCR පද්ධතිවල ද්විත්ව නූල් DNA වලට නිශ්චිතව බැඳිය නොහැකි අතර බන්ධනය මත ප්රතිදීප්ත විය හැක.
PCR චක්‍ර වැඩි වීමත් සමඟ ප්රතික්රියා පද්ධතියේ ප්රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය ඝාතීය ලෙස වැඩි විය.ප්රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය හඳුනා ගැනීමෙන්, ප්රතික්රියා පද්ධතියේ DNA වර්ධක ප්‍රමාණය තත්‍ය කාලීනව නිරීක්ෂණය කළ හැකි අතර, පසුව නියැදියේ ආරම්භක අච්චුවේ ප්‍රමාණය ප්‍රතිලෝමව තක්සේරු කළ හැක.
【ප්රතිදීප්ත පරීක්ෂණ ක්රමයේ මූලධර්මය】
ප්රතිදීප්ත පරීක්ෂණයන්‍යෂ්ටික අම්ල අනුපිළිවෙලක් වන අතර එය 5′ අන්තයේ ප්රතිදීප්ත කණ්ඩායමක් සහ 3′ අන්තයේ නිවාදැමීමේ කණ්ඩායමක් සහිත වන අතර එය සැකිල්ලට නිශ්චිතව බැඳිය හැක.පරීක්ෂණය නොවෙනස්ව පවතින විට, ෆ්ලෝරෝෆෝරයෙන් විමෝචනය වන ප්‍රතිදීප්තතාව නිවාදැමීමේ කණ්ඩායම විසින් නිවා දමනු ලබන අතර ප්රතිදීප්ත විය නොහැක.පරීක්ෂණය දිරාපත් වූ විට, ප්රතිදීප්ත ද්රව්යය විඝටනය වී ප්රතිදීප්ත විමෝචනය කරයි.
PCR ප්රතික්රියා විසඳුම සඳහා ප්රතිදීප්ත පරීක්ෂණයක් එකතු කරනු ලැබේ.නිර්වින්දන ක්‍රියාවලියේදී, ප්රතිදීප්ත පරීක්ෂණය අච්චුවේ නිශ්චිත ස්ථානයට බැඳී ඇත.විස්තීරණ ක්‍රියාවලියේදී, PCR එන්සයිමයේ 5′→3′ exonuclease ක්‍රියාකාරකම් මඟින් අච්චුව සමඟ දෙමුහුන් කරන ලද ප්රතිදීප්ත පරීක්ෂණය දිරාපත් කළ හැකි අතර ප්රතිදීප්ත ද්රව්යය ප්රතිදීප්ත විමෝචනය කිරීමට විඝටනය වේ.ප්රතික්රියා පද්ධතියේ පරීක්ෂණයේ ප්රතිදීප්ත තීව්‍රතාවය හඳුනා ගැනීමෙන්, PCR නිෂ්පාදනයේ විස්තාරණ ප්‍රමාණය නිරීක්ෂණය කිරීමේ අරමුණ සාක්ෂාත් කරගත හැකිය.
【ප්රතිදීප්ත හඳුනාගැනීමේ ක්රමය තෝරාගැනීම】
එය ඉහළ සමජාතීය සමඟ අනුපිළිවෙලවල් වෙන්කර හඳුනා ගැනීමට සහ SNP ටයිප් කිරීමේ විශ්ලේෂණය වැනි බහුවිධ PCR හඳුනාගැනීම සිදු කිරීමට භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්රතිදීප්ත පරීක්ෂණ ක්රමය ප්‍රතිස්ථාපනය කළ නොහැක.
අනෙකුත් රියල් ටයිම් PCR අත්හදා බැලීම් සඳහා, සරල, පහසු සහ අඩු වියදම් ප්රතිදීප්ත චයිමේරා ක්‍රමයක් භාවිතා කළ හැක.
| ඩයි ක්රමය | පරීක්ෂණ ක්රමය | |
| වාසිය | සරල, අඩු පිරිවැය, නිශ්චිතව සංස්ලේෂණය කිරීම අවශ්ය නොවේ |
probesප්‍රබල විශේෂත්වය, බහුවිධ PCR හැකියාව ඇත
අඩුපාඩුවක්
විස්තාරණය සඳහා ඉහළ නිශ්චිත අවශ්යතා;
මල්ටිප්ලෙක්ස් PCR සිදු කළ නොහැක විශේෂිත පරීක්ෂණ සැලසුම් කිරීමට අවශ්ය, අධික පිරිවැය;
සමහර විට පරීක්ෂණ නිර්මාණය අපහසු වේ
ආශ්රිත නිෂ්පාදන:
පසු කාලය: අගෝස්තු-18-2022
