PCR, බහු PCR, ස්ථානීය PCR, ප්‍රතිලෝම PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

අපි විවිධ PCR වල සංකල්ප, පියවර සහ විස්තර වර්ග කරන්නෙමු

Ⅰ. PCR

PCR ලෙස හඳුන්වන Polymerase Chain Reaction යනු නිශ්චිත DNA කොටස් විශාල කිරීමට භාවිතා කරන අණුක ජීව විද්‍යාත්මක තාක්ෂණයකි.එය vitro තුළ විශේෂ DNA අනුකරණයක් ලෙස සැලකිය හැකිය.DNA පොලිමරේස් (DNA Polymerase I) 1955 දී සොයා ගන්නා ලද අතර, පර්යේෂණාත්මක වටිනාකමක් සහ ප්‍රායෝගිකත්වයක් ඇති E. Coli හි Klenow Fragment 1970 ගණන්වල මුල් භාගයේදී Dr. H. Klenow විසින් සොයා ගන්නා ලදී, නමුත් මෙම එන්සයිමය උෂ්ණත්වය නොඉවසන බැවින්, අධික උෂ්ණත්වය එය පිරිහීමට ලක්විය හැක, එබැවින් එය පොලිමර්ස් ප්‍රතික්‍රියාව සමඟ ඉහළ ප්‍රතික්‍රියාවක් සිදු නොවේ.වර්තමානයේ භාවිතා වන එන්සයිම (ටැක් පොලිමරේස් ලෙස හැඳින්වේ), 1976 දී උණුසුම් වසන්ත බැක්ටීරියාවක් වන Thermus aquaticus වෙතින් හුදකලා විය. එහි ලක්ෂණය වන්නේ එය අධික උෂ්ණත්වයට ඔරොත්තු දිය හැකි අතර එය කදිම එන්සයිමයක් වන නමුත් එය 1980 දශකයෙන් පසුව බහුලව භාවිතා වේ.PCR හි මුල් ප්‍රාථමික මූලාකෘතියේ මුල් සංකල්පය ජාන අලුත්වැඩියාව සහ පිටපත් කිරීම හා සමාන වේ, එය 1971 දී Dr. KJell Kleppe විසින් යෝජනා කරන ලදී. ඔහු පළමු සරල හා කෙටි කාලීන ජාන පිටපත ප්‍රකාශයට පත් කළේය (PR හි පළමු චක්‍ර ප්‍රතික්‍රියා දෙකට සමාන).අද දියුණු කරන ලද PCR 1983 දී Dr. Kary B. Mullis විසින් සංවර්ධනය කරන ලදී. Dr. Mullis එම වසරේ PE සමාගම්වලට සේවය කළ බැවින් PE හට PCR කර්මාන්තයේ විශේෂ තත්වයක් ඇත.වෛද්‍ය මුල්ලිස් විසින් සයිකි සහ අනෙකුත් අය සමඟ 1985 දී ප්‍රථම අදාළ පත්‍රිකාව නිල වශයෙන් ප්‍රකාශයට පත් කරන ලදී. එතැන් පටන් PCR භාවිතය දිනකට සැතපුම් දහස් ගණනක් වන අතර, අදාළ පත්‍රිකාවල ගුණාත්මක භාවය තවත් බොහෝ පර්යේෂණ ක්‍රමවලට අප්‍රසන්න බව පැවසිය හැකිය.පසුව, PCR තාක්ෂණය ජෛව විද්‍යාත්මක පර්යේෂණ සහ සායනික යෙදුම් සඳහා බහුලව භාවිතා වන අතර, අණුක ජීව විද්‍යා පර්යේෂණවල වැදගත්ම තාක්ෂණය බවට පත් විය.මුල්ලිස්ට 1993 රසායන විද්‍යාව සඳහා වූ නොබෙල් ත්‍යාගයද හිමි විය.

PCRමූලධර්මය

PCR තාක්ෂණයේ මූලික මූලධර්මය DNA වල ස්වභාවික ප්‍රතිනිර්මාණ ක්‍රියාවලියට සමාන වන අතර, එහි විශේෂත්වය ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි අන්ත දෙකටම අනුපූරක වන oligonucleotide ප්‍රාථමිකය මත රඳා පවතී.PCR සමන්විත වන්නේ පරිහානිය-ඇනීලිං-දිගු කිරීමේ මූලික ප්‍රතික්‍රියා පියවර තුනකින්: ① DNA සැකිල්ල පරිහානිය: DNA සැකිල්ල යම් කාලයක් සඳහා 93°C පමණ රත් කළ පසු, PCR වර්ධකයෙන් සාදන ලද ද්විත්ව දාම DNA සඳහා ද්විත්ව DNA ද්‍රාවණය, DNA තනි ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා ප්‍රමුඛතම ප්‍රතික්‍රියාවක් බවට පත් කළ හැකි වන පරිදි එය ප්‍රථමික වට ප්‍රතික්‍රියාවක් බවට පත් කළ හැක.② DNA සැකිල්ලේ සහ ප්‍රාථමිකයේ ඇනීලනය (සංයුක්තය): DNA අච්චුව රත් කර තනි දාමයකට පරිහානියට පත් වූ පසු උෂ්ණත්වය 55°C පමණ දක්වා පහත වැටේ.ප්‍රාථමිකයේ අනුපූරක අනුපිළිවෙල සහ අච්චු DNA තනි දාමය.ප්‍රාථමිකයේ දිගුව: DNA සැකිල්ල - ප්‍රාථමික බන්ධනය TaqDNA පොලිමරේස් ක්‍රියාව මත පදනම් වේ, ප්‍රතික්‍රියා අමුද්‍රව්‍ය ලෙස dNTP වේ.ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේ මූලධර්මය තබා ගන්න, DNA දාමයට අනුපූරක වන නව අර්ධ වෙන් කළ පිටපත් දාමයක් සංස්ලේෂණය කරන්න, සහ නැවත නැවත චක්‍ර පරිහානිය-ඇනීලිං-දිගුව ක්‍රියාවලි තුනකින් වැඩි “අර්ධ වෙන් කළ පිටපත් දාමයක්” ලබා ගත හැකි අතර, මෙම නව දාමය නැවත ලබා ගත හැකිය ඊළඟ චක්‍රය සඳහා අච්චුවක් වන්න.ලූපය සම්පූර්ණ කිරීමට මිනිත්තු 2-4 ක් ගතවේ, ඉලක්කගත ජානය පැය 2-3 කින් මිලියන කිහිප වතාවක් විස්තාරණය කළ හැකිය.

සම්මතPCRප්රතික්රියා පද්ධතිය

PCR ප්රතික්රියාවේ මූලද්රව්ය පහක්

PCR ප්‍රතික්‍රියාවට ප්‍රධාන වශයෙන් ද්‍රව්‍ය වර්ග පහක් ඇතුළත් වේ, එනම් ප්‍රයිමර්, එන්සයිම, dNTP, සැකිල්ල සහ බෆරය (Mg2+ අවශ්‍ය වේ).[PCR පටිපාටිය]

සම්මත PCR ක්රියාවලිය පියවර තුනකට බෙදා ඇත

1. DNA පරිහානිය (90°C-96°C): තාප ක්‍රියාව යටතේ ද්විත්ව දාම DNA සැකිලි, හයිඩ්‍රජන් බන්ධන බිඳී, තනි දාම DNA සාදයි.

2. Annealing (25℃ -65℃): පද්ධතියේ උෂ්ණත්වය අඩු වේ, ප්‍රාථමිකය DNA අච්චුව සමඟ ඒකාබද්ධ කර දේශීය ද්විත්ව දාමයක් සාදයි.

3. දිගුව (70℃ -75℃): Taq එන්සයිමයේ ක්‍රියාව යටතේ (72°C පමණ, හොඳම ක්‍රියාකාරකම), dNTP අමුද්‍රව්‍ය ලෙස භාවිතා කරයි, ප්‍රයිමර් → 3′ අන්තයේ 5′ අන්තයේ සිට විහිදේ, සංස්ලේෂණය සහ අච්චුව එකිනෙක DNA දාමයට අනුපූරක වේ.

සෑම චක්‍රයක්ම denatured, annealed සහ දීර්ඝ කර, DNA අන්තර්ගතය දෙගුණ කරයි.දැනට, කෙටි විස්තාරණ ප්‍රදේශය හේතුවෙන්, Taq එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය ප්‍රශස්ත නොවුනත්, සමහර PCR ඉතා කෙටි කාලයක් තුළ ප්‍රතිනිර්මාණය කළ හැකිය, එබැවින් එය පියවර දෙකකට වෙනස් කළ හැකිය, එනම්, 60 ° C-65 ° C උෂ්ණත්වයකදී ඇනීල් කිරීම සහ දිගු කිරීම එකවර සිදු කළ හැකිය.එසවීම සහ සිසිලනය කිරීමේ ක්රියාවලිය අඩු කිරීම සහ ප්රතිචාර වේගය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා.

PCR ප්රතික්රියා විශේෂාංග

● ඉහළ විශේෂත්වය

PCR ප්‍රතිචාරයේ නිශ්චිත තීරනාත්මක සාධක වන්නේ: ① ප්‍රාථමිකයේ සහ DNA අච්චුවේ නිශ්චිත සංයෝජනය.②පාද යුගලයේ මූලධර්මය.③ TaqDNA පොලිමරේස් සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාවේ පක්ෂපාතිත්වය.④ ඉලක්කගත ජානයේ විශේෂත්වය සහ ගතානුගතිකත්වය.

ප්‍රයිමර් සහ සැකිලි වල නිවැරදි සංයෝජනය ප්‍රධාන වේ.ප්‍රාථමිකය සහ අච්චුව බැඳීම සහ ප්‍රාථමික දාමයේ දිගුව ක්ෂාරීය පාදක ගැලපීමේ මූලධර්මය මත පදනම් වේ.පොලිමරේස් සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියා වල පක්ෂපාතීත්වය සහ ප්‍රතික්‍රියාවේ අච්චුව සහ ප්‍රාථමිකයේ බන්ධනය (සංයුක්තය) සෑදීම සඳහා Taq DNA පොලිමරේස් හි ඉහළ උෂ්ණත්ව ප්‍රතිරෝධය ඉහළ උෂ්ණත්වයකදී සිදු කළ හැක.සංයෝජනයේ විශේෂත්වය බෙහෙවින් වැඩි වේ.ක්ලිප් එකට ඉහළ නිරවද්‍යතාවයක් පවත්වා ගත හැක.ඉහළ ගතානුගතිකත්වයක් සහ ඉහළ ගතානුගතිකත්වයක් සහිත ඉලක්කගත ජාන කලාපයක් තෝරාගැනීමෙන්, එහි විශේෂත්වය වැඩි වේ.

● ඉහළ සංවේදීතාව

PCR නිෂ්පාදනවල නිෂ්පාදන පරිමාව දර්ශකය මගින් වැඩි කරනු ලබන අතර, මයික්‍රොග්‍රෑම් (μg= -6) මට්ටම දක්වා ක්ෂුද්‍ර පාලක මට්ටම වැඩි කිරීම සඳහා පිකර් (PG=10-12) හි ආරම්භක අච්චුව පුළුල් කළ හැක.ඉලක්කගත සෛල මිලියන 1කින් හඳුනාගත හැක;වෛරස් හඳුනාගැනීමේදී, PCR හි සංවේදීතාව RFU 3 දක්වා ළඟා විය හැකිය (හිස් පැල්ලම් පිහිටුවා ඒකක);බැක්ටීරියා විද්‍යාවේ අවම හඳුනාගැනීමේ අනුපාතය බැක්ටීරියා 3 කි.

● සරල සහ වේගවත්

PCR පරාවර්තනය ඉහළ-උෂ්ණත්ව Taq DNA පොලිමරේස් භාවිතා කරයි, එය එක් වරකදී ප්‍රතික්‍රියා ද්‍රාවණය එකතු කරයි, එනම් DNA විස්තාරණ ද්‍රාවණය සහ ජල ස්නානය කිරීමේ භාජනය මත පරිහානිය-ඇනියල්-දිගු ප්‍රතික්‍රියාවකි.සාමාන්‍යයෙන්, විස්තාරණ ප්‍රතික්‍රියාව පැය 2 සිට 4 දක්වා අවසන් වේ.වැඩි දියුණු කරන ලද නිෂ්පාදන සාමාන්‍යයෙන් විද්‍යුත් කඩුවකින් විශ්ලේෂණය කරනු ලබන අතර සමස්ථානික භාවිතා කිරීමට අවශ්‍ය නොවේ, විකිරණශීලී දූෂණයක් නොමැත, සහ පහසු ප්‍රවර්ධනයක්.

● නිදර්ශකයේ සංශුද්ධතාවය අඩුය

වෛරස් හෝ බැක්ටීරියා සහ සංස්කෘතික සෛල වෙන් කිරීම අවශ්ය නොවේ.DNA බොර නිෂ්පාදන සහ RNA ඇම්ප්ලිෆයර් ලෙස භාවිතා කළ හැක.DNA වර්ධක හඳුනාගැනීම රුධිරය, ශරීර දියර, කැස්ස සේදීමේ තරලය, හිසකෙස්, සෛල සහ සජීවී පටක වැනි සායනික නිදර්ශක භාවිතයෙන් සෘජුවම භාවිතා කළ හැක.

PCRපොදු ගැටළු

● සාවද්‍ය සෘණ, විස්තාරණය කළ කලාප නොමැත

PCR ප්‍රතික්‍රියාවේ ප්‍රධාන අවධීන් අතරට ඇතුළත් වන්නේ: ① සැකිලි න්‍යෂ්ටික අම්ල සැකසීම, ② ප්‍රයිමර්වල ගුණාත්මකභාවය සහ විශේෂත්වය, ③ එන්සයිමවල ගුණාත්මකභාවය ④ PCR චක්‍ර තත්ත්වයන්.හේතුව සොයා ගැනීම ද ඉහත සබැඳි සඳහා විශ්ලේෂණය කර අධ්‍යයනය කළ යුතුය.

සැකිලි: ① සැකිල්ලේ විවිධ ප්‍රෝටීන අඩංගු වේ, ② සැකිල්ලේ Taq එන්සයිම නිෂේධකයක් අඩංගු වේ, ③ සැකිල්ලේ ඇති ප්‍රෝටීන් ඉවත් නොකෙරේ, විශේෂයෙන් වර්ණදේහයේ ඇති කණ්ඩායම් ප්‍රෝටීන්.⑤ ඩිමිනර් න්‍යෂ්ටික අම්ල පරිහානිය පරිපූර්ණ නොවේ.එන්සයිම සහ ප්‍රයිමර් වල ගුණාත්මක භාවය හොඳ වන විට, විස්තාරණ කලාපයක් නොමැත, එය බොහෝ විට නිදර්ශකවල ආහාර දිරවීමේ ප්‍රතිකාරයයි.සැකිල්ල න්යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණ ක්රියාවලියේ යම් දෝෂයක් ඇත, එබැවින් ඵලදායී හා ස්ථාවර ආහාර දිරවීමේ විසඳුමක් සකස් කිරීම සඳහා, එහි ක්රියා පටිපාටිය ස්ථාවර කළ යුතු අතර අත්තනෝමතික ලෙස වෙනස් නොකළ යුතුය.

එන්සයිම අක්‍රිය වීම: නව එන්සයිමයක් හෝ පැරණි සහ නව එන්සයිම දෙකම එකට භාවිතා කර එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය නැති වී හෝ ප්‍රමාණවත් නොවීම, ව්‍යාජ සෘණවලට තුඩු දෙයි.Taq එන්සයිම හෝ එතිඩියම් බ්රෝමයිඩ් සමහර විට අමතක වී ඇති බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය.

ප්‍රයිමර්: ප්‍රාථමිකයේ ගුණය, ප්‍රාථමිකයේ සාන්ද්‍රණය සහ ප්‍රයිමර් දෙකේ සාන්ද්‍රණය සමමිතිකද යන්න.එය PCR අසාර්ථක වීමට පොදු හේතුවක් හෝ වැඩිවන කලාපය පරිපූර්ණ නොවන අතර විසරණය වීමට ඉඩ ඇත.සමහර කාණ්ඩ අංක වල ප්‍රයිමර් වල ගුණාත්මක භාවය පිළිබඳ ගැටළු තිබේ.ප්‍රයිමර් දෙකෙහි ඉහළ සාන්ද්‍රණයක් සහ අඩු සාන්ද්‍රණයක් ඇති අතර, අඩු කාර්යක්ෂමතාවයෙන් යුත් අසමමිතික විස්තාරණය ඇති කරයි.ප්‍රතිවිරෝධතා නම්: ① ඒකක සංස්ලේෂණය කිරීමට හොඳ ප්‍රාථමිකයක් තෝරන්න.② ප්‍රයිමරයේ සාන්ද්‍රණය රඳා පවතින්නේ OD අගය මත පමණක් නොව, ඒගාර් ෂුගර් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් සෑදීම සඳහා ප්‍රාථමිකයේ මුල් ද්‍රවය කෙරෙහි අවධානය යොමු කරයි.ප්‍රාථමික තීරු කලාපයක් තිබිය යුතු අතර, ප්‍රාථමික දෙකේ දීප්තිය සාමාන්‍යයෙන් අනුකූල විය යුතුය.මෙම අවස්ථාවේදී බෙල්ට්, PCR අසමත් විය හැකි අතර, එය ප්‍රාථමික සංශ්ලේෂණ ඒකකය සමඟ විසඳිය යුතුය.ප්‍රාථමිකයක් ඉහළ නම්, දීප්තිය අඩු වන අතර, තනුක කළ විට එහි සාන්ද්‍රණය සමතුලිත විය යුතුය.③ ප්‍රයිමරය ගෙවා ගබඩා කළ යුත්තේ ශීතකරණයේ බහු ශීතකිරීම් හෝ දිගු කාලීන ශීතකරණ කොටස් වැලැක්වීම සඳහා ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් ගබඩා කළ යුතු අතර එමඟින් ප්‍රයිමරය පිරිහීමට හා දිරාපත් වීමට හේතු වේ.④ ප්‍රයිමරයේ දිග ප්‍රමාණවත් නොවීම සහ ප්‍රයිමර් අතර ඩි පොකුර සෑදී තිබීම වැනි ප්‍රයිමරයේ සැලසුම අසාධාරණ ය.

Mg2+සාන්ද්‍රණය: Mg2+අයන සාන්ද්‍රණය PCR වර්ධක කාර්යක්ෂමතාවයට විශාල බලපෑමක් ඇති කරයි.අධික සාන්ද්රණය PCR වර්ධකයේ විරුද්ධ ලිංගයේ අඩු කළ හැක.සාන්ද්‍රණය ඉතා අඩු නම්, PCR වර්ධක ප්‍රතිදානය මඟින් ප්‍රසාරණ කලාපය නොමැතිව PCR වර්ධක අසාර්ථක වීම පවා සිදු කරයි.

ප්‍රතික්‍රියා පරිමාව වෙනස් කිරීම: PCR වර්ධකයේදී භාවිතා කරන පරිමාව 20ul, 30ul, සහ 50ul හෝ 100uL වේ, PCR විස්තාරණය සඳහා වන යෙදුමේ විශාල පරිමාව විද්‍යාත්මක පර්යේෂණ සහ සායනික පරීක්ෂණවල විවිධ අරමුණු අනුව සකසා ඇත.20ul වැනි කුඩා වෙළුම් සෑදීමෙන් පසු, ප්‍රමාණය සෑදීමේදී ලණු තත්වයක් සෑදිය යුතුය, එසේ නොවුවහොත් එය අසාර්ථක වනු ඇත.

භෞතික හේතු: PCR විස්තාරණය සඳහා පරිවර්තනය ඉතා වැදගත් වේ.ක්ෂය වීමේ උෂ්ණත්වය අඩු නම්, පරිහානිය කාලය කෙටි වේ, එය ව්යාජ සෘණාත්මකව සිදු වීමට ඉඩ ඇත;ඉතා අඩු උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය විශේෂිත නොවන විස්තාරණයට හේතු විය හැකි අතර නිශ්චිත විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව අඩු කරයි.PCR විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව අඩු කිරීම සඳහා ප්‍රයිමර් සහ සැකිලි සංයෝජනයට බෙහෙවින් බලපායි.සමහර විට PCR අසාර්ථක වීමට එක් හේතුවක් වන දිගුවේ හෝ ජල ද්‍රාව්‍ය කුකර්හි විචල්‍යතාවය, විචලනය සහ දිගු උෂ්ණත්වය හඳුනා ගැනීම සඳහා සම්මත උෂ්ණත්වමාන භාවිතා කිරීම අවශ්‍ය වේ.

ඉලක්ක අනුක්‍රමය ප්‍රභේද: ඉලක්ක අනුක්‍රමය සිදුවුවහොත්, විකෘතියක් හෝ මකාදැමීමක්, මූලාකෘතියේ සහ අච්චුවේ සංයෝජනයක් ඒකාබද්ධ වේ, නැතහොත් ඉලක්ක අනුපිළිවෙලක් නොමැතිකම නිසා, ප්‍රාථමිකය සහ අච්චුව අනුපූරක අනුපිළිවෙල අහිමි වනු ඇති අතර, එහි PCR විස්තාරණය සාර්ථක නොවනු ඇත.

● වැරදි ධනාත්මක

PCR විස්තාරණ කලාපය ඉලක්කගත අනුක්‍රමික කලාපයට අනුකූලව දිස්වන අතර සමහර විට එහි කලාපය වඩාත් පිළිවෙලට සහ ඉහළ වේ.

ප්‍රාථමික සැලසුම සුදුසු නොවේ: තෝරාගත් විස්තාරණ අනුපිළිවෙල සහ අරමුණු නොවන විස්තාරණ අනුපිළිවෙල සමජාතීය වේ, එබැවින් PCR විස්තාරණය කරන විට, විස්තාරණය කරන ලද PCR නිෂ්පාදන අරමුණු නොවන අනුපිළිවෙල වේ.ඉලක්ක අනුක්‍රමය ඉතා කෙටි හෝ ප්‍රාථමිකය ඉතා කෙටි වන අතර එය ව්‍යාජ ධනයට ගොදුරු වේ.නැවත සැලසුම් කරන්න ඕන.

ඉලක්ක අනුපිළිවෙල හෝ වර්ධක නිෂ්පාදනවල හරස් දූෂණය: මෙම දූෂණයට හේතු දෙකක් තිබේ: පළමුව, සම්පූර්ණ ජෙනෝමය හෝ විශාල කොටස්වල හරස් දූෂණය, ව්‍යාජ ධනාත්මක තත්ත්වයන්ට මග පාදයි.පහත සඳහන් ක්‍රම මගින් මෙවැනි සාවද්‍ය ධන නිරාකරණය කළ හැක: ඉලක්ක අනුක්‍රමය නියැදි තුවක්කුවට ආශ්වාස කිරීම හෝ කේන්ද්‍රාපසාරී නලයෙන් ඉවතට විසිවීම වැළැක්වීමට ක්‍රියා කිරීමේදී ප්‍රවේශම් සහ මෘදු වන්න.ඉහළ උෂ්ණත්වයන්ට ඔරොත්තු නොදෙන එන්සයිම සහ ද්රව්ය හැර, සියලුම ප්රතික්රියාකාරක හෝ උපකරණ අධි පීඩනයකින් විෂබීජහරණය කළ යුතුය.කේන්ද්රාපසාරී පයිප්ප සහ සාම්පල එකවර භාවිතා කළ යුතුය.අවශ්ය විට, නිදර්ශක එකතු කිරීමට පෙර, පවතින න්යෂ්ටික අම්ලය විනාශ කිරීම සඳහා ප්රතික්රියා නල සහ ප්රතික්රියාකාරකය පාරජම්බුල කිරණවලට නිරාවරණය වේ.දෙවනුව, වායු දූෂණයේ කුඩා කොටස්.මෙම කුඩා කොටස් ඉලක්ක අනුපිළිවෙලට වඩා කෙටි වන නමුත් ඒවාට නිශ්චිත සමජාතීයතාවයක් ඇත.එය එකිනෙකා සමඟ බෙදිය හැකිය.ප්‍රයිමර් අනුපූරකයෙන් පසු, PCR නිෂ්පාදනය පුළුල් කළ හැකි අතර, එය ව්‍යාජ ධනාත්මක නිෂ්පාදනයක් ඇති කරයි.එය කූඩුව PCR ක්රමය අඩු කිරීමට හෝ ඉවත් කිරීමට භාවිතා කළ හැක.

● නිශ්චිත නොවන විස්තාරණ කලාපයක් දිස්වේ

PCR වර්ධකයෙන් පසුව දිස් වූ පටි, අපේක්ෂිත ප්‍රමාණයට නොගැලපේ, හෝ විශාල හෝ කුඩා, හෝ එම අවස්ථාවේදීම, හෝ එම අවස්ථාවේදීම, විශේෂිත විස්තාරණ කලාප සහ විශේෂිත නොවන විස්තාරණ පටි.විශේෂිත නොවන කලාපවල මතුවීම නම්: පළමුව, ප්‍රාථමිකයන් ඉලක්ක අනුපිළිවෙලට අසම්පූර්ණ අනුපූරක වේ, නැතහොත් ද්වි පොකුරක් සෑදීමට ප්‍රාථමිකයේ බහුඅවයවීකරණය වේ.දෙවැන්න නම්, MG2+ අයනවල සාන්ද්‍රණය ඉතා ඉහළ මට්ටමක පැවතීම, උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය ඉතා අඩු වීම සහ PCR චක්‍ර ගණන සම්බන්ධ වීමයි.දෙවනුව, එන්සයිමවල ගුණාත්මකභාවය සහ ප්රමාණය.බොහෝ විට, සමහර මූලාශ්‍රවල එන්සයිම විශේෂ නොවන කලාපවලට ගොදුරු වන අතර අනෙක් ප්‍රභවයේ එන්සයිම සිදු නොවේ.සමහර විට එන්සයිමවල විශේෂිත නොවන විස්තාරණය ද සිදු වේ.ප්‍රතිවිරෝධතා නම්: අවශ්‍ය නම් නැවත සැලසුම් කරන ලද ආකර්ශනීය.එන්සයිම ප්‍රමාණය අඩු කරන්න හෝ වෙනත් ප්‍රභවයක එන්සයිම ප්‍රතිස්ථාපනය කරන්න.ප්‍රාථමික ප්‍රමාණය අඩු කරන්න, නියමිත පරිදි සැකිලි ප්‍රමාණය වැඩි කරන්න, සහ චක්‍ර ගණන අඩු කරන්න.උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය නිසි ලෙස වැඩි කරන්න හෝ උෂ්ණත්ව ලක්ෂ්‍ය දෙකේ ක්‍රමය භාවිතා කරන්න (93 ° C පරිහානිය, 65 ° C දී ඇනීම සහ දිගු කිරීම).

● පියලි ඇදීම හෝ ස්මියර් ටේප් පෙනේ

PCR විස්තාරණය සමහර විට යොදන ලද හෝ ෂෙල් වෙඩි හෝ කාපට් වැනි පටියක් ලෙස පෙනේ.හේතුව නිසා, එන්සයිමවල අධික ප්‍රමාණය හෝ එන්සයිමයේ දුර්වල ගුණාත්මක බව නිසා, dNTP සාන්ද්‍රණය ඉතා ඉහළ ය, Mg2+ සාන්ද්‍රණය ඉතා ඉහළ ය, උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය ඉතා අඩු ය, සහ චක්‍ර ගණන ඉතා වැඩි ය.ප්‍රතිවිරෝධතා නම්: ①එන්සයිම ප්‍රමාණය අඩු කිරීම හෝ වෙනත් ප්‍රභවයක එන්සයිම වෙනස් කිරීම.②dNTP සාන්ද්‍රණය අඩු කිරීම ③Mg2+ සාන්ද්‍රණය නිසි ලෙස අඩු කරන්න.④ සැකිලි ප්‍රමාණය වැඩි කර චක්‍ර ගණන අඩු කරන්න.

ආශ්රිත නිෂ්පාදන

PCR Heroᴹ (ඩයි සහිත)

◮ ඉහළ විශ්වාසවන්තභාවය: සාමාන්‍ය Taq එන්සයිම මෙන් 6 ගුණයක්;

◮ වේගවත් විස්තාරණ වේගය

◮ තවත් අච්චු අනුවර්තනය වීමේ හැකියාව

◮ ඉහළ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව

◮ පාරිසරික ඉවසීම වඩා ශක්තිමත් ය: සතියක් සඳහා 37 ° C දී තබා, 90% කට වඩා වැඩි ක්රියාකාරිත්වයක් පවත්වා ගැනීම;

◮ එහි 5'→3' DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරකම් සහ 3'→5' exonuclease ක්‍රියාකාරකම් නොමැතිව 5'→3' exonuclease ක්‍රියාකාරකම් ඇත.

PCR පහසු (ඩයි සහිත)

අද්විතීය ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය සහ ඉහළ කාර්යක්ෂම Taq DNA පොලිමරේස් PCR ප්‍රතික්‍රියාව ඉහළ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයක්, විශේෂත්වයක් සහ සංවේදීතාවයක් ඇති කරයි.

RT-qPCR පහසු (එක් පියවරක්)-SYBR හරිත I

◮ එක්-පියවර කට්ටලය එකම නලයක් තුළ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ qPCR ප්‍රතික්‍රියා දෙකක් සිදු කරයි, අච්චු RNA, නිශ්චිත PCR ප්‍රයිමර් සහ RNase-Free ddH එකතු කිරීමට පමණක් අවශ්‍ය වේ.₂O.

◮ කට්ටලයට ඉක්මනින් සහ කාර්යක්ෂමව ප්‍රමාණාත්මකව වෛරස් RNA විශ්ලේෂණය කිරීමට හෝ RNA සොයා ගැනීමට හැකිය.

◮ කට්ටලය ප්‍රතික්‍රියාවේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සහ විශේෂත්වය ඵලදායි ලෙස වැඩිදියුණු කිරීම සඳහා අද්විතීය ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් සහ Foregene HotStar Taq DNA පොලිමරේස් අද්විතීය ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියක් සමඟ ඒකාබද්ධව භාවිතා කරයි.

◮ ප්‍රශස්ත ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය ප්‍රතික්‍රියාවට ඉහළ හඳුනාගැනීමේ සංවේදීතාවයක්, ශක්තිමත් තාප ස්ථායීතාවයක් සහ වඩා හොඳ ඉවසීමක් ඇති කරයි.

◮ RT-qPCR පහසුයි^TM(එක් පියවරක්)-SYBR Green I කට්ටලය ROX අභ්‍යන්තර යොමු සායම් සමඟ එන අතර, සංඥා පසුබිම සහ ළිං අතර සංඥා දෝෂ ඉවත් කිරීමට භාවිතා කළ හැකි අතර, පාරිභෝගිකයින්ට ප්‍රමාණාත්මක PCR උපකරණවල විවිධ මාදිලිවල භාවිතා කිරීමට පහසු වේ.

RT පහසුයි^TMII (Master Premix සඳහා සඳහා පළමු කෙඳි cDNA සංස්ලේෂණයරියල් ටයිම් PCR)

- විනාඩි 2 ක් ඇතුළත අච්චුවේ ඇති gDNA ඉවත් කළ හැකි gDNA ඉවත් කිරීමට කාර්යක්ෂම හැකියාව.

-කාර්යක්ෂම ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පද්ධතිය, පළමු කෙඳි cDNA සංශ්ලේෂණය සම්පූර්ණ කිරීමට ගත වන්නේ මිනිත්තු 15ක් පමණි.

-සංකීර්ණ සැකිලි: ඉහළ GC අන්තර්ගතය සහ සංකීර්ණ ද්විතියික ව්‍යුහය සහිත සැකිලි ද ඉහළ කාර්යක්ෂමතාවයකින් ආපසු හැරවිය හැක.

-ඉහළ සංවේදී ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පද්ධතිය, pg මට්ටමේ සැකිලි ද උසස් තත්ත්වයේ cDNA ලබා ගත හැක.

-ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පද්ධතියට ඉහළ තාප ස්ථායීතාවයක් ඇත, ප්‍රශස්ත ප්‍රතික්‍රියා උෂ්ණත්වය 42℃ වන අතර එය තවමත් 50℃ හි හොඳ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්ය සාධනයක් ඇත.