PCR (පොලිමරේස් දාම ප්‍රතික්‍රියාව) යනු වසර 30කට වැඩි ඉතිහාසයක් ඇති in-vitro DNA විස්තාරණ තාක්ෂණයන්ගෙන් එකකි.

PCR තාක්ෂණය 1983 දී ඇමරිකා එක්සත් ජනපදයේ Cetus හි Kary Mullis විසින් පුරෝගාමී විය. මුල්ලිස් 1985 දී PCR පේටන්ට් බලපත්‍රයක් සඳහා ඉල්ලුම් කළ අතර එම වසරේම විද්‍යාව පිළිබඳ පළමු PCR අධ්‍යයන පත්‍රය ප්‍රකාශයට පත් කරන ලදී.මුල්ලිස් 1993 දී රසායන විද්‍යාව සඳහා නොබෙල් ත්‍යාගය පිරිනමන ලදී.

PCR හි මූලික මූලධර්ම

PCR මගින් ඉලක්කගත DNA කොටස් මිලියනයකට වඩා වැඩි වාර ගණනක් විස්තාරණය කළ හැකිය.මූලධර්මය DNA පොලිමරේස් උත්ප්‍රේරණය යටතේ පවතින අතර, මාපිය තන්තු DNA සැකිල්ලක් ලෙස සහ නිශ්චිත ප්‍රාථමිකය දිගු කිරීම සඳහා ආරම්භක ලක්ෂ්‍යය ලෙස භාවිතා කරයි.එය denaturation, annealing, and extension වැනි පියවර හරහා vitro තුළ ප්‍රතිනිර්මාණය වේ.ඩීඑන්ඒ මාපිය තන්තු අච්චුවට අනුපූරක දියණියක DNA ක්‍රියාවලිය.

සම්මත PCR ක්රියාවලිය පියවර තුනකට බෙදා ඇත:

1.Denaturation: DNA ද්විත්ව කෙඳි වෙන් කිරීමට ඉහළ උෂ්ණත්වය භාවිතා කරන්න.DNA ද්විත්ව කෙඳි අතර හයිඩ්‍රජන් බන්ධනය ඉහළ උෂ්ණත්වයකදී (93-98℃) කැඩී යයි.

2. Annealing: ද්විත්ව නූල් DNA වෙන් කළ පසු උෂ්ණත්වය අඩු කරන්න එවිට ප්‍රාථමිකය තනි කෙඳි DNA සමඟ බැඳිය හැක.

3.දිගුව: DNA පොලිමරේස් උෂ්ණත්වය පහත හෙලන විට බැඳුනු ප්‍රයිමර් වලින් DNA කෙඳි දිගේ අනුපූරක කෙඳි සංස්ලේෂණය කිරීමට පටන් ගනී.දිගුව සම්පූර්ණ වූ විට, චක්රයක් සම්පූර්ණ වන අතර, DNA කොටස් සංඛ්යාව දෙගුණ වේ

මෙම පියවර තුන 25-35 වාරයක් ප්‍රතිවර්තනය කිරීමෙන් DNA කොටස් සංඛ්‍යාව ඝාතීය ලෙස වැඩි වේ.

PCR හි ඇති දක්ෂතාවය නම් විවිධ ඉලක්කගත ජාන සඳහා විවිධ ප්‍රාථමිකයන් නිර්මාණය කළ හැකි අතර එමඟින් ඉලක්කගත ජාන කොටස් කෙටි කාලයක් තුළ විස්තාරණය කළ හැකිය.

මේ වන විට PCR සාමාන්‍ය PCR, fluorescent Quantitative PCR සහ ඩිජිටල් PCR ලෙස වර්ග තුනකට බෙදිය හැකිය.

සාමාන්‍ය PCR හි පළමු පරම්පරාව

ඉලක්කගත ජානය විස්තාරණය කිරීම සඳහා සාමාන්‍ය PCR විස්තාරණ උපකරණයක් භාවිතා කරන්න, ඉන්පසු නිෂ්පාදනය හඳුනා ගැනීම සඳහා ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් භාවිතා කරන්න, කළ හැක්කේ ගුණාත්මක විශ්ලේෂණයක් පමණි.

පළමු පරම්පරාවේ PCR හි ප්රධාන අවාසි:

1.විශේෂිත නොවන විස්තාරණය සහ ව්‍යාජ ධනාත්මක ප්‍රතිඵල වලට ගොදුරු වීම.

2. හඳුනාගැනීම සඳහා බොහෝ කාලයක් ගත වන අතර මෙහෙයුම අපහසු වේ.

3. ගුණාත්මක පරීක්ෂණයක් පමණක් කළ හැකිය

දෙවන පරම්පරාවේ තත්‍ය කාලීන PCR

තත්‍ය කාලීන PCR, qPCR ලෙසද හැඳින්වේ, ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියේ ප්‍රගතිය දැක්විය හැකි ප්‍රතිදීප්ත පරීක්ෂණ භාවිතා කරයි, සහ ප්‍රතිදීප්ත සංඥා සමුච්චය කිරීම හරහා වර්ධක නිෂ්පාදන සමුච්චය වීම නිරීක්ෂණය කරයි, සහ ප්‍රතිදීප්ත වක්‍රය හරහා ප්‍රතිඵල විනිශ්චය කරයි.එය Cq අගය සහ සම්මත වක්‍රය ආධාරයෙන් ප්‍රමාණ කළ හැක.

qPCR තාක්ෂණය සංවෘත පද්ධතියක් තුළ සිදු කරනු ලබන නිසා, දූෂණය වීමේ සම්භාවිතාව අඩු වන අතර, ප්‍රමාණාත්මක හඳුනාගැනීම සඳහා ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව නිරීක්ෂණය කළ හැක, එබැවින් එය සායනික භාවිතයේ බහුලව භාවිතා වන අතර PCR හි ප්‍රමුඛ තාක්‍ෂණය බවට පත්ව ඇත.

තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR හි භාවිතා වන ප්‍රතිදීප්ත ද්‍රව්‍ය පහත පරිදි බෙදිය හැකිය: TaqMan ප්‍රතිදීප්ත පරීක්ෂණය, අණුක බීකන්ස් සහ ප්‍රතිදීප්ත සායම්.

1) TaqMan fluorescent probe:

PCR විස්තාරණය අතරතුර, ප්‍රයිමර් යුගලයක් එකතු කරන අතරතුර නිශ්චිත ප්‍රතිදීප්ත පරීක්ෂණයක් එකතු වේ.පරීක්ෂණය ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩයක් වන අතර, දෙපස වාර්තාකරු ප්‍රතිදීප්ත කණ්ඩායමක් සහ නිවාදැමීමේ ප්‍රතිදීප්ත කන්ඩායමක් ලෙස ලේබල් කර ඇත.

පරීක්ෂණය නොවෙනස්ව පවතින විට, වාර්තාකරු කණ්ඩායම විසින් නිකුත් කරන ලද ප්රතිදීප්ත සංඥාව නිවාදැමීමේ කණ්ඩායම විසින් අවශෝෂණය කරනු ලැබේ;PCR වර්ධකයේදී, Taq එන්සයිමයේ 5′-3′ exonuclease ක්‍රියාකාරීත්වය විමර්ශනය කැඩී බිඳී ගොස්, වාර්තාකරු ප්‍රතිදීප්ත කන්ඩායම සහ නිවාදැමීම බවට පත් කරයි, ප්‍රතිදීප්ත සමූහය වෙන් කරනු ලැබේ, එවිට ප්‍රතිදීප්ත නිරීක්ෂණ පද්ධතියට ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව ලබා ගත හැකිය, එනම්, සෑම අවස්ථාවකදීම ප්‍රතිදීප්ත සංඥව ලබා ගත හැකි අතර, එය ප්‍රතිදීප්ත සං signal ාවක් සෑදී ඇති අතර, එය ප්‍රතිදීප්ත ව්‍යුහයක් සෑදී ඇත. ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව සම්පුර්ණයෙන්ම PCR නිෂ්පාදනය සෑදීම සමග සමමුහුර්ත වේ.

2) SYBR ප්‍රතිදීප්ත සායම්:

PCR ප්රතික්රියා පද්ධතියේ දී, SYBR ප්රතිදීප්ත සායම් අතිරික්තයක් එකතු වේ.SYBR ප්‍රතිදීප්ත සායම් DNA ද්විත්ව තන්තුවලට නිශ්චිතව ඇතුළත් නොකළ පසු, එය ප්‍රතිදීප්ත සංඥාවක් නිකුත් කරයි.දාමයට ඇතුළත් නොකළ SYBR සායම් අණුව කිසිදු ප්රතිදීප්ත සංඥාවක් නිකුත් නොකරනු ඇත, එමගින් ප්රතිදීප්ත සංඥාව සහතික කිරීම PCR නිෂ්පාදනවල වැඩිවීම PCR නිෂ්පාදනවල වැඩිවීම සමඟ සම්පුර්ණයෙන්ම සමමුහුර්ත වේ.SYBR බන්ධනය වන්නේ ද්විත්ව නූල් DNA වලට පමණි, එබැවින් PCR ප්‍රතික්‍රියාව නිශ්චිතද යන්න තීරණය කිරීමට ද්‍රවාංක වක්‍රය භාවිතා කළ හැක.

3) අණුක ආලෝකය:

එය කඳ-ලූප් ද්විත්ව ලේබල් කරන ලද ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ පරීක්ෂණයක් වන අතර එය 5 සහ 3 කෙළවරේ පාද 8 ක පමණ කෙස් කටු ව්‍යුහයක් සාදයි.දෙපස ඇති න්‍යෂ්ටික අම්ල අනුපිළිවෙල අනුපූරක ලෙස යුගලනය වී ඇති අතර එමඟින් ප්‍රතිදීප්ත කණ්ඩායම සහ නිවාදැමීමේ කණ්ඩායම දැඩි වේ.වසා දමන්න, ප්‍රතිදීප්තියක් නිපදවන්නේ නැත.

PCR නිෂ්පාදනය උත්පාදනය කිරීමෙන් පසු, ඇනලීම් ක්‍රියාවලියේදී, අණුක බීකනයේ මැද කොටස නිශ්චිත DNA අනුපිළිවෙලක් සමඟ යුගලනය කර ඇති අතර, ප්‍රතිදීප්ත ජානය නිවාදැමීමේ ජානයෙන් වෙන් කර ප්‍රතිදීප්තියක් ඇති කරයි.

දෙවන පරම්පරාවේ PCR හි ප්රධාන අවාසි:

සංවේදීතාව තවමත් නොමැති අතර, අඩු පිටපත් නිදර්ශක හඳුනාගැනීම වැරදිය.

පසුබිම් අගයේ බලපෑම ඇති අතර, ප්රතිඵලය මැදිහත් වීමට ඉඩ ඇත.

ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියේ PCR නිෂේධක ඇති විට, හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිඵල මැදිහත්වීම්වලට ගොදුරු වේ.

තුන්වන පරම්පරාවේ ඩිජිටල් PCR

ඩිජිටල් PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි පිටපත් අංකය අවසාන ලක්ෂ්‍ය හඳුනාගැනීම හරහා ගණනය කරන අතර අභ්‍යන්තර පාලන සහ සම්මත වක්‍ර භාවිතා නොකර නිවැරදි නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණාත්මක අනාවරණයක් සිදු කළ හැක.

ඩිජිටල් PCR අවසන් ලක්ෂ්‍ය හඳුනාගැනීම භාවිතා කරන අතර Ct අගය (චක්‍ර සීමාව) මත රඳා නොපවතී, එබැවින් ඩිජිටල් PCR ප්‍රතික්‍රියාව විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයෙන් අඩු බලපෑමක් ඇති කරයි, සහ PCR ප්‍රතික්‍රියා නිෂේධක සඳහා ඉවසීම ඉහළ නිරවද්‍යතාවයකින් සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනයකින් වැඩි දියුණු වේ.

ඉහළ සංවේදීතාවයේ සහ ඉහළ නිරවද්‍යතාවයේ ලක්ෂණ නිසා, එය PCR ප්‍රතික්‍රියා නිෂේධක මගින් පහසුවෙන් මැදිහත් නොවන අතර, පර්යේෂණ සහ යෙදුම් උණුසුම් ස්ථානයක් බවට පත් වී ඇති සම්මත නිෂ්පාදන නොමැතිව සත්‍ය නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණයක් ලබා ගත හැකිය.

ප්‍රතික්‍රියා ඒකකයේ විවිධ ස්වරූපවලට අනුව, එය ප්‍රධාන වර්ග තුනකට බෙදිය හැකිය: ක්ෂුද්‍ර තරල, චිප් සහ ජල බිඳිති පද්ධති.

1) ක්ෂුද්‍ර තරල ඩිජිටල් PCR, mdPCR:

ක්ෂුද්ර තරල තාක්ෂණය මත පදනම්ව, DNA සැකිල්ල වෙන් කරනු ලැබේ.ක්ෂුද්‍ර තරල තාක්‍ෂණයට නියැදි නැනෝ උත්ශ්‍රේණි කිරීම හෝ කුඩා ජල බිඳිති උත්පාදනය අවබෝධ කර ගත හැක, නමුත් ජල බිඳිති සඳහා විශේෂ අවශෝෂණ ක්‍රමයක් අවශ්‍ය වන අතර පසුව PCR ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය සමඟ ඒකාබද්ධ වේ.mdPCR ක්‍රමයෙන් වෙනත් ක්‍රම මගින් ප්‍රතිස්ථාපනය කර ඇත.

2) ජල බිඳිති මත පදනම් වූ ඩිජිටල් PCR, ddPCR:

නියැදිය බිංදු බවට සැකසීමට ජලය-තෙල් බිංදු උත්පාදන තාක්ෂණය භාවිතා කරන්න, සහ න්‍යෂ්ටික අම්ල අණු අඩංගු ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය නැනෝ පරිමාණයේ ජල බිඳිති දහස් ගණනකට බෙදන්න, ඒ සෑම එකක්ම න්‍යෂ්ටික අම්ල ඉලක්ක අණුවක් අඩංගු නොවේ, හෝ පරීක්‍ෂා කළ යුතු න්‍යෂ්ටික අම්ල ඉලක්ක අණු එකක් හෝ කිහිපයක් අඩංගු වේ.

3) චිප් මත පදනම් වූ ඩිජිටල් PCR, cdPCR:

සිලිකන් වේෆර් හෝ ක්වාර්ට්ස් වීදුරු මත බොහෝ ක්ෂුද්‍ර ටියුබ් සහ ක්ෂුද්‍ර කුහර කැටයම් කිරීමට සහ විවිධ පාලන කපාට හරහා ද්‍රාවණයේ ගලායාම පාලනය කිරීමට සහ නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණනය ලබා ගැනීම සඳහා නියැදි ද්‍රව ඩිජිටල් PCR ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා ප්‍රතික්‍රියා ළිංවලට එකම ප්‍රමාණයේ නැනෝමීටරවලට බෙදීමට ඒකාබද්ධ ද්‍රව මාර්ග තාක්ෂණය භාවිතා කරන්න.

තෙවන පරම්පරාවේ PCR හි ප්රධාන අවාසි:

උපකරණ සහ ප්රතික්රියාකාරක මිල අධිකයි.

අච්චු තත්ත්ව අවශ්‍යතා ඉහළයි.සැකිලි ප්‍රමාණය ක්ෂුද්‍ර පද්ධති ප්‍රමාණය ඉක්මවා ගියහොත්, එය ප්‍රමාණ කිරීමට නොහැකි වනු ඇත, එය ඉතා කුඩා නම්, ප්‍රමාණ කිරීමේ නිරවද්‍යතාවය අඩු වේ.

විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක් ඇති විට ව්‍යාජ ධනාත්මක ද ජනනය විය හැක.