හැමෝම කතා කරන්නේ qRT-PCR අත්හදා බැලීමේ මූලධර්මය, ප්‍රාථමික නිර්මාණය, ප්‍රතිඵල අර්ථ නිරූපණය යනාදිය ගැන ය, නමුත් මම ඔබ සමඟ qRT-PCR හි පර්යේෂණාත්මක ක්‍රියාකාරිත්වය බෙදා ගත යුතු යැයි සිතමි.එය කුඩා, නමුත් එය ප්රතිඵල ගැන.

qRT-PCR කිරීමට පෙර, අපට අපගේම RNA සහ මෙහෙයුම් ක්‍රම පිළිබඳව පැහැදිලි අවබෝධයක් තිබිය යුතුය.සියල්ලට පසු, අපගේ උත්සාහයන් හුදෙක් අභ්‍යාස කරනවාට වඩා ප්‍රතිඵල ලබා ගැනීම අරමුණු කර ගෙන ඇත.එබැවින් qRT-PCR කිරීමට පෙර, අපි පහත ගැටළු තීරණය කළ යුතුය (ඒවායින් සමහරක් SYBR සඳහා පමණක් අදාළ වේ).

1 ඔබේ RNA ක්ෂය වී නැති බව ඔබට විශ්වාසද?

NanoDrop 2000 හට RNA හි සාන්ද්‍රණය සහ සංශුද්ධතාවය පමණක් හඳුනාගත හැකි නමුත් RNA හි අඛණ්ඩතාව හඳුනාගත නොහැක.

RNA (RNA Intesity Number) අගය මගින් Agilent 2100 Bioanalyzer පද්ධතිය මගින් අනාවරණය කරගත් RNA හි අඛණ්ඩතාව පිළිබිඹු කළ හැක.

Fig. විවිධ RNA සාම්පල සඳහා RIN අගයන්හි ක්‍රමානුරූප රූප සටහන (යුකැරියෝට්)

කෙසේ වෙතත්, රසායනාගාරවල සාමාන්‍යයෙන් Agilent 2100 Bioanalyzer නොමැත.මෙම අවස්ථාවේ දී, අපට formaldehyde gel හරහා හඳුනා ගත හැක, නමුත් RNA මුළු ප්‍රමාණය සඳහා අවශ්‍යතාවය ඉහළ බැවින් වේගවත්ම ක්‍රමය සාමාන්‍ය ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය භාවිතා කිරීමයි.එය න්‍යෂ්ටික රහිත පරිසරයක තිබීම අවශ්‍ය වේ, එබැවින් විද්‍යුත් විච්ඡේදක ටැංකිය, සෝල් බෝතලය, ජෙල් වරහන සහ පනාව DEPC ජලයෙන් සේදීම අවශ්‍ය වේ.ඇගරෝස් ද න්‍යෂ්ටික රහිත ය (එය නැවුම් ලෙස විවෘත කර ඇති තාක්) සහ පැටවීමේ බෆරය 1.2% ජෙල් සමඟ හැකිතාක් නැවුම්ව විවෘත කළ යුතුය.

ජෙල් සම්පූර්ණයෙන්ම විසුරුවා හැරිය යුතු බව සලකන්න, එසේ නොමැති නම්, රූපයේ නියැදි 9 හි පෙන්වා ඇති පරිදි එය සමජාතීය පටි ඇති කරයි.වෝල්ටීයතාවය වැඩි නම් හෝ වැඩි වේලාවක් ධාවනය වුවහොත් තාපය ජනනය වන අතර RNA හායනය ඇති කරයි, එබැවින් වෝල්ටීයතාවය සහ කාලය සාධාරණ ලෙස පාලනය කළ යුතුය.මීට අමතරව, ජෙල් ධාවනය මඟින් නියැදියේ DNA අපද්‍රව්‍ය තිබේද යන්න තවදුරටත් තීරණය කළ හැකි අතර, බෙදා හැරීමේ ළිඳෙහි රඳවා තබා ඇති පටි විශාල සංඛ්‍යාවක් තිබේද යන්න නිරීක්ෂණය කළ හැකිය.

රූපය.RNA වල ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් හඳුනාගැනීම

2 ඔබේ cDNA සාන්ද්‍රණය ගැන ඔබට විශ්වාසද?

විද්‍යාගාරයේ ඉන්න ලොකු අයියලාගේ අත්දැකීම නම්, එක් එක් ප්‍රතිලෝමයෙන් ලබා ගන්නා 20 ul පද්ධතියේ cDNA සෘජුවම 20X තනුක වන අතර පශ්චාත් ආචාර්ය උපාධිධාරී සහෝදරියන් 10X තනුක කර ඇති බවයි.මම සාමාන්යයෙන් තත්වය මත රඳා පවතී.එක් එක් පුද්ගලයා සඳහන් කරන RNA වල ගුණාත්මක භාවය වෙනස් නිසා, ආපසු හැරවීමේ මට්ටම ද වෙනස් වන අතර, ආපසු හැරවීමේ තාක්ෂණය ස්ථායී නොවිය හැක.

එබැවින් මම ආපසු හැරවූ cDNA ලබා ගන්නා සෑම අවස්ථාවකම, මම මුලින්ම එය 3 වතාවක් පමණ තනුක කර, පසුව RT-PCR කිරීමට ගෘහ පාලන ජානය භාවිතා කරමි, චක්‍ර සංඛ්‍යාව සාමාන්‍යයෙන් චක්‍ර 25 කි, නිශ්චිත සාන්ද්‍රණය හඳුනා ගැනීමට, පසුව අවසාන තනුක සාධකය තීරණය කරන්න.

3 ඔබේ ප්‍රයිමර් භාවිතා කිරීමට පහසු බව ඔබට විශ්වාසද?

එය qRT-PCR හි දියවන වක්‍රය පසුකර යා හැක, නමුත් මේ සඳහා තවමත් මුදල් වැය වේ.විශාල මුදලක් නැති රසායනාගාර සඳහා, ප්‍රයිමර් විශාල ප්‍රමාණයක් ලැබුණු විට, සාමාන්‍ය RT-PCR භාවිතා කර එය තනි පටියක් දැයි බැලීමට සහ ප්‍රයිමර් වල විශේෂත්වය හඳුනා ගැනීමට ඔවුන්ට හැකිය.රසායනාගාරයට මුදල් හිඟයක් නොමැති නම්, දියවන වක්‍රය හරහා සියලුම ප්‍රාථමික වල විශේෂත්වය එක් වරක් හඳුනාගත හැකිය.

4 ඔබගේ පර්යේෂණාත්මක කොන්දේසි සුදුසු බව ඔබට විශ්වාසද?

SYBR ප්‍රබල ආලෝකයෙන් ආරක්‍ෂා කළ යුතුය, එබැවින් SYBR ප්‍රතික්‍රියාකාරකය එකතු කිරීමේදී උඩිස් ආලෝකය නිවා දැමීමට උත්සාහ කරන්න, එය සම්පූර්ණ කිරීමට අඳුරු ආලෝකය පමණක් භාවිතා කිරීමට අවශ්‍ය වේ.

SYBR 4 ° C දී ගබඩා කරන්න.භාවිතා කරන විට, පෙණ නැගීම වළක්වා ගැනීම සඳහා හොඳින් මිශ්‍ර කිරීම සඳහා මෘදු ලෙස ඉහළට සහ පහළට පෙරළන්න, සහ ප්‍රබල ලෙස සුළි නොවන්න.

සමහර නංගිලා PCR බෝඩ් එකේ ලකුණු අඳින්න කැමති සාම්පල් මිශ්‍ර වෙයි කියන බයට, ඒක වැරදියි.ඔබේ සලකුණු ප්‍රතිදීප්ත සංඥා එකතුවට බලපෑම් කිරීමට බොහෝ දුරට ඉඩ ඇති බැවින්, පහත දැක්වෙන පරිදි මතකය සඳහා සහාය වීමට පර්යේෂණාත්මක සටහන් පොත් භාවිතා කරන ලෙස මම සාමාන්‍යයෙන් කනිෂ්ඨයන්ට නිර්දේශ කරමි.

රූපය.qRT-PCR සාම්පල පැටවීමේ රූප සටහන

5 ඔබ එය නිවැරදිව කරන බව ඔබට විශ්වාසද?

අත්වැසුම් පැළඳීමට, අත්වැසුම් පැළඳීමට, අත්වැසුම් පැළඳීමට සහ වැදගත් දේවල් තුන් වරක් කියන්නට වග බලා ගන්න.

SYBR ආලෝකයට නිරාවරණය වීම අඩු කිරීම සඳහා, මම පෞද්ගලිකව පහත රූපයේ දැක්වෙන පරිදි පළමුව අච්චුවක් එක් කිරීමට කැමතියි.අත්දැකීමට අනුව, සැකිලි කුඩා ප්‍රමාණයක් එකතු කිරීම නියැදි දෝෂ ඇතිවීමට ඉඩ ඇත.එමනිසා, කුඩා අච්චුවක් එකතු කිරීමෙන් සිදුවන දෝෂය අවම කිරීම සඳහා, මම සාමාන්‍යයෙන් සාම්පල නැවත දෙගුණ කරන අතර, H2O2 එකතු කරන ප්‍රමාණය අඩු කිරීම සඳහා නියැදිය එකතු කරන විට එම ප්‍රමාණය දෙගුණ කරමි.

රූපය.qRT-PCR පැටවීමේ ක්‍රමානුරූප රූප සටහන

ඉන්පසු qRT-PCR පද්ධතිය පහත පරිදි වින්‍යාස කරන්න.

රූපය.qRT-PCR පද්ධති සකස් කිරීමේ රූප සටහන

සටහන: වින්‍යාස කිරීමේ ක්‍රියාවලිය අයිස් මත සිදු කළ යුතුය.

නියැදිය එකතු කිරීමෙන් පසු විනිවිද පෙනෙන මුද්රා තැබීමේ චිත්රපටය අලවන්න.ඔබේ අත් මගින් විනිවිද පෙනෙන මුද්රා තැබීමේ චිත්රපටයේ මතුපිට ස්පර්ශ නොකිරීමට උත්සාහ කරන්න, චිත්රපටයේ දෙපැත්තේ ඇති අවකාශයේ සිට ක්රියාත්මක කරන්න.මක්නිසාද යත් ඇඟිලි සලකුණු ප්‍රතිදීප්ත සංඥා එකතු කිරීමට ද බලපාන බැවිනි.ඉන්පසු නියැදිය බිත්තියේ එල්ලීම වැලැක්වීම සඳහා අඩු වේගයකින් තත්පර 10 ක් ඉක්මනින් කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීමට කේන්ද්‍රාපසාරී භාවිතා කරන්න.

ආශ්රිත නිෂ්පාදන:

සෛල සෘජු RT-qPCR කට්ටලය

RT පහසු II