RT-qPCR සාමාන්ය PCR තාක්ෂණයෙන් නිපදවා ඇත.එය සාම්ප්‍රදායික PCR ප්රතික්රියා පද්ධතියට ප්රතිදීප්ත රසායනික ද්රව්ය (ප්රතිදීප්ත ඩයි හෝ ප්රතිදීප්ත ගවේෂණ) එකතු කරන අතර, ඒවායේ විවිධ ප්‍රදීප යාන්ත්‍රණයන්ට අනුව PCR ඇනීල් සහ විස්තීරණ ක්රියාවලිය තත්‍ය කාලීනව හඳුනා ගනී.PCR හි එක් එක් චක්‍රයේ නිෂ්පාදන වෙනස්වීම් ප්‍රමාණය ගණනය කිරීම සඳහා මාධ්‍යයේ ප්රතිදීප්ත සංඥා වෙනස්වීම් භාවිතා වේ.වර්තමානයේ, වඩාත් පොදු ක්රම වන්නේ ප්රතිදීප්ත සායම් ක්රමය සහ පරීක්ෂණ ක්රමයයි.
ප්රතිදීප්ත සායම් ක්රමය:
SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO යනාදී සමහර ප්රතිදීප්ත සායම් තමන් විසින්ම ආලෝකය විමෝචනය නොකරන නමුත් dsDNA හි කුඩා වලයට බැඳීමෙන් පසු ප්රතිදීප්ත විමෝචනය කරයි.එබැවින්, PCR ප්රතික්රියාවේ ආරම්භයේ දී, යන්ත්රය ප්රතිදීප්ත සංඥාව හඳුනාගත නොහැකිය.ප්‍රතික්‍රියාව annealing-extension (ද්වි-පියවර ක්රමය) හෝ දිගු කිරීමේ අදියර (තුන්-පියවර ක්රමය) වෙත යන විට, මෙම අවස්ථාවේදී ද්විත්ව කෙඳි විවෘත වන අතර, නව DNA පොලිමරේස් නූල් සංස්ලේෂණය අතරතුර, ප්රතිදීප්ත අණු dsDNA කුඩා වලක් තුළ ඒකාබද්ධ කර ප්රතිදීප්ත විමෝචනය කරයි.PCR චක්‍ර ගණන වැඩි වන විට, වැඩි වැඩියෙන් ඩයි වර්ග dsDNA සමඟ ඒකාබද්ධ වන අතර ප්රතිදීප්ත සංඥාව ද අඛණ්ඩව වැඩි දියුණු වේ.උදාහරණයක් ලෙස SYBR Green Ⅰ ගන්න.
පරීක්ෂණ ක්රමය:
Taqman ගවේෂණය යනු බහුලව භාවිතා වන ජල විච්ඡේදක පරීක්ෂණයයි.පරීක්ෂණයේ 5′ කෙළවරේ ප්රතිදීප්ත කණ්ඩායමක් ඇත, සාමාන්‍යයෙන් FAM.පරීක්ෂණය ඉලක්කගත ජානයට අනුපූරක අනුපිළිවෙලකි.ෆ්ලෝරෝෆෝරයේ 3′ අන්තයේ ප්රතිදීප්ත නිවාදැමීමේ කණ්ඩායමක් ඇත.ප්රතිදීප්ත අනුනාද ශක්ති හුවමාරු මූලධර්මය අනුව (Förster resonance energy transfer, FRET), වාර්තාකරු ප්රතිදීප්ත කන්ඩායම (දානපති ප්රතිදීප්ත අණුව) සහ නිවාදැමීමේ ප්රතිදීප්ත කන්ඩායම (ප්රතිදීප්ත ප්රතිදීප්ත අණුව) උත්තේජක වර්ණාවලිය අතිච්ඡාදනය වන විට, ධාන්‍ය 7 දුර ප්‍රමාණය ඉතා ආසන්න වේ. ප්‍රතිග්‍රාහක අණුවේ ප්‍රතිදීප්තතාව, ස්වයං ප්‍රතිදීප්තතාව දුර්වල වේ.එබැවින්, PCR ප්රතික්රියාවේ ආරම්භයේ දී, පරීක්ෂණය නොමිලේ සහ පද්ධතිය තුළ නොවෙනස්ව පවතින විට, වාර්තාකරු ප්රතිදීප්ත කණ්ඩායම ප්රතිදීප්ත විමෝචනය නොකරයි.ඇනීල් කරන විට, ප්‍රයිමරය සහ ප්‍රෝබ් එක අච්චුවට බැඳේ.දිගු කිරීමේ අවධියේදී, පොලිමරේස් අඛණ්ඩව නව දාම සංස්ලේෂණය කරයි.DNA පොලිමරේස් 5′-3′ exonuclease ක්‍රියාකාරකම් ඇත.පරීක්ෂණයට ළඟා වන විට, DNA පොලිමරේස් විසින් සැකිල්ලෙන් පරීක්ෂණය ජල විච්ඡේදනය කරයි, වාර්තාකරු ප්රතිදීප්ත කණ්ඩායම නිවාදැමීමේ ප්රතිදීප්ත කාණ්ඩයෙන් වෙන් කර ප්රතිදීප්ත සංඥාව මුදා හරිනු ඇත.පරීක්ෂණය සහ අච්චුව අතර එකින් එක සම්බන්ධයක් ඇති බැවින්, පරීක්ෂණයේ නිරවද්‍යතාවය සහ සංවේදීතාව අනුව පරීක්ෂණ ක්රමය සායම් ක්‍රමයට වඩා උසස් වේ.
රූපය 1 qRT-PCR මූලධර්මය
ප්‍රයිමර් නිර්මාණය
මූලධර්ම:
ප්‍රාථමිකයන් න්‍යෂ්ටික අම්ල ශ්‍රේණියේ සංරක්‍ෂිත කලාපය තුළ නිර්මාණය කළ යුතු අතර විශේෂත්වයක් තිබිය යුතුය.
cDNA අනුපිළිවෙල භාවිතා කිරීම වඩාත් සුදුසු වන අතර mRNA අනුපිළිවෙල ද පිළිගත හැකිය.එසේ නොවේ නම්, DNA අනුක්‍රමයේ cds කලාපයේ සැලසුම සොයා ගන්න.
ප්රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක නිෂ්පාදනයේ දිග 80-150bp වේ, දිගම එක 300bp වේ, ප්‍රාථමික දිග සාමාන්‍යයෙන් 17-25 භෂ්ම අතර වන අතර උඩුගං සහ පහළ ප්‍රයිමර් අතර වෙනස ඉතා විශාල නොවිය යුතුය.
G+C අන්තර්ගතය 40% සහ 60% අතර වන අතර 45-55% හොඳම වේ.
TM අගය අංශක 58-62 අතර වේ.
ප්‍රයිමර් ඩයිමර් සහ ස්වයං-ඩයිමර් වළක්වා ගැනීමට උත්සාහ කරන්න, (අඛණ්ඩ අනුපූරක භෂ්ම යුගල 4 කට වඩා නොපෙනේ) හිසකෙස් ව්‍යුහය, නොවැළැක්විය හැකි නම්, ΔG<4.5kJ/mol* කරන්න, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේදී gDNA ඉවත් කර ඇති බව ඔබට සහතික කළ නොහැකි නම්, GDNA ඉවත් කර ඇති බව සහතික කර ගත නොහැකි නම්, GDN හි ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කිරීම වඩාත් සුදුසුය. T/C, A/G අඛණ්ඩ ව්‍යුහය (2-3) ප්‍රාථමික සහ නොවන
විශේෂිත විෂමජාතීය ලෙස විස්තාරණය කරන ලද අනුපිළිවෙලෙහි සමජාතීයතාවය 70% ට වඩා අඩු හෝ අනුපූරක පාදක සමජාතීය 8 ක් ඇත.
දත්ත සමුදාය:
CottonFGD මූල පද මගින් සෙවීම
ප්‍රාථමික නිර්මාණය:
IDT-qPCR ප්‍රාථමික නිර්මාණය
Fig2 IDT ඔන්ලයින් ප්‍රයිමර් නිර්මාණ මෙවලම් පිටුව
Fig3 ප්රතිඵල පිටු සංදර්ශකය
lncRNA ප්‍රයිමර් නිර්මාණය:
lncRNA:mRNA හා සමාන පියවර.
miRNA:කඳ-ලූප් ක්‍රමයේ මූලධර්මය: සියලුම miRNAs 23 nt පමණ කෙටි අනුපිළිවෙලක් බැවින්, සෘජු PCR හඳුනාගැනීම සිදු කළ නොහැක, එබැවින් කඳ-ලූප් අනුක්‍රමය මෙවලම භාවිතා වේ.කඳ-ලූප් අනුපිළිවෙල යනු තනි කෙඳි සහිත DNA 50 nt පමණ වන අතර, එය විසින්ම හිසකෙස් ව්‍යුහයක් සෑදිය හැක.3 'අවසානය miRNA අර්ධ ඛණ්ඩනයට අනුපූරක අනුපිළිවෙලක් ලෙස සැලසුම් කළ හැක, එවිට ඉලක්කගත miRNA ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේදී කඳ-ලූප් අනුපිළිවෙලට සම්බන්ධ කළ හැකි අතර, සම්පූර්ණ දිග 70bp දක්වා ළඟා විය හැක, එය qPCR විසින් තීරණය කරන ලද වර්ධක නිෂ්පාදනයේ දිගට අනුකූල වේ.Tailing miRNA ප්‍රයිමර් නිර්මාණය .
වර්ධක-විශේෂිත හඳුනාගැනීම:
ඔන්ලයින් පිපිරුම් දත්ත සමුදාය: CottonFGD පිපිරවීම අනුපිළිවෙල සමානතාවයෙන්
Local blast: Local blast කිරීමට Blast+ භාවිතා කරන්න, linux සහ macos වලට කෙලින්ම දේශීය දත්ත ගබඩාවක් පිහිටුවිය හැක, ubuntu bash ස්ථාපනය කිරීමෙන් පසු win10 පද්ධතියද සිදු කල හැක.දේශීය පිපිරුම් දත්ත සමුදාය සහ දේශීය පිපිරීමක් සාදන්න;win10 මත ubuntu bash විවෘත කරන්න.
සටහන: උඩරට කපු සහ මුහුදු දූපත් කපු ටෙට්‍රාප්ලොයිඩ් භෝග වන අතර, එම නිසා පිපිරුමේ ප්‍රතිඵලය බොහෝ විට ගැලපීම් දෙකක් හෝ වැඩි ගණනක් වනු ඇත.අතීතයේදී, පිපිරවීම සිදු කිරීම සඳහා දත්ත සමුදායක් ලෙස NAU cds භාවිතා කිරීමෙන් SNP වෙනස්කම් කිහිපයක් පමණක් ඇති සමජාතීය ජාන දෙකක් සොයා ගැනීමට ඉඩ ඇත.සාමාන්‍යයෙන්, සමජාතීය ජාන දෙක ප්‍රාථමික මෝස්තරයෙන් වෙන් කළ නොහැක, එබැවින් ඒවා සමාන ලෙස සලකනු ලැබේ.පැහැදිලි indel එකක් තිබේ නම්, ප්‍රාථමිකය සාමාන්‍යයෙන් ඉන්ඩෙල් මත නිර්මාණය කර ඇත, නමුත් මෙය ප්‍රාථමිකයේ ද්විතියික ව්‍යුහයට හේතු විය හැක නිදහස් ශක්තිය වැඩි වේ, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව අඩුවීමට තුඩු දෙයි, නමුත් මෙය නොවැළැක්විය හැකිය.
ප්‍රාථමික ද්විතියික ව්‍යුහය හඳුනාගැනීම:
පියවර:විවෘත ඔලිගෝ 7 → ආදාන අච්චු අනුපිළිවෙල → උප කවුළුව වසන්න → සුරකින්න → අච්චුව මත ප්‍රාථමිකය සොයා ගන්න, ප්‍රයිමරයේ දිග සැකසීමට ctrl+D ඔබන්න → ස්වයං-ඩයිමරීකරණය ශරීරය, විෂමකරණය, හිසකෙස්, නොගැලපීම වැනි විවිධ ද්විතීයික ව්‍යුහයන් විශ්ලේෂණය කරන්න. රූපයේ අවසාන ප්රතිඵල දෙක වන්නේ රූපයේ ප්‍රයිමර් දෙකයි.ඉදිරිපස ප්‍රාථමිකයේ ප්‍රති result ලය හොඳයි, පැහැදිලි ඩයිමර් සහ හිසකෙස් ව්‍යුහයක් නොමැත, අඛණ්ඩ අනුපූරක පදනමක් නොමැත, සහ නිදහස් ශක්තියේ නිරපේක්ෂ අගය 4.5 ට වඩා අඩු වන අතර, පසුපස ප්‍රාථමිකය අඛණ්ඩව පෙන්වන අතර පාද 6 අනුපූරක වන අතර නිදහස් ශක්තිය 8.8 වේ;ඊට අමතරව, 3′ අන්තයේ වඩාත් බැරෑරුම් ඩයිමරයක් දිස්වන අතර අනුගාමී පාද 4 ක ඩිමරයක් දිස්වේ.නිදහස් ශක්තිය ඉහළ මට්ටමක නොතිබුණද, 3′ dimer Chl විස්තාරණ විශේෂත්වය සහ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයට බරපතල ලෙස බලපෑ හැකිය.මීට අමතරව, හිසකෙස්, හෙටරොඩිමර් සහ නොගැලපීම් සඳහා පරීක්ෂා කිරීම අවශ්ය වේ.
Fig3 oligo7 හඳුනාගැනීමේ ප්රතිඵල
වර්ධක කාර්යක්ෂමතාව හඳුනාගැනීම:
PCR ප්රතික්රියාවේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව PCR ප්රතිඵලවලට බරපතල ලෙස බලපායි.එසේම qRT-PCR හි, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව ප්‍රමාණාත්මක ප්රතිඵල සඳහා විශේෂයෙන් වැදගත් වේ.ප්රතික්රියා බෆරයේ අනෙකුත් ද්රව්ය, යන්ත්ර සහ ප්රොටෝකෝල ඉවත් කරන්න.ප්‍රයිමර් වල ගුණාත්මක භාවය qRT-PCR හි විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව කෙරෙහි ද විශාල බලපෑමක් ඇති කරයි.ප්‍රතිඵලවල නිරවද්‍යතාවය සහතික කිරීම සඳහා, සාපේක්ෂ ප්රතිදීප්ත ප්‍රමාණකරණය සහ නිරපේක්ෂ ප්රතිදීප්ත ප්‍රමාණකරණය යන දෙකටම ප්‍රයිමර්වල විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව හඳුනා ගැනීමට අවශ්ය වේ.ඵලදායී qRT-PCR විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 85% සහ 115% අතර බව හඳුනාගෙන ඇත.ක්රම දෙකක් තිබේ:
1. සම්මත වක්‍ර ක්රමය:
ඒ.cDNA මිශ්ර කරන්න
බී.අනුක්‍රමික තනුක කිරීම
c.qPCR
ඈවිස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව ගණනය කිරීම සඳහා රේඛීය ප්‍රතිගාමී සමීකරණය
2. LinRegPCR
LinRegPCR යනු තත්‍ය කාලීන RT-PCR දත්ත විශ්ලේෂණය සඳහා වන වැඩසටහනකි, එය SYBR හරිත හෝ සමාන රසායන විද්‍යාව මත පදනම් වූ ප්‍රමාණාත්මක PCR (qPCR) දත්ත ලෙසද හැඳින්වේ.වැඩසටහන මූලික නොවන නිවැරදි කළ දත්ත භාවිතා කරයි, එක් එක් නියැදිය මත මූලික නිවැරදි කිරීමක් වෙන වෙනම සිදු කරයි, රේඛීය කවුළුවක් තීරණය කරයි, ඉන්පසු PCR දත්ත කට්ටලය හරහා සරල රේඛාවක් සවි කිරීමට රේඛීය ප්‍රතිගාමී විශ්ලේෂණය භාවිතා කරයි.මෙම රේඛාවේ බෑවුමෙන් එක් එක් නියැදියක PCR කාර්යක්ෂමතාව ගණනය කෙරේ.අත්තනෝමතික ප්රතිදීප්ත ඒකකවල ප්‍රකාශිත නියැදියකට ආරම්භක සාන්ද්‍රණයක් ගණනය කිරීමට ඇම්ප්ලිකොන් එකකට මධ්‍යන්‍ය PCR කාර්යක්ෂමතාව සහ නියැදියකට Ct අගය භාවිතා කරයි.දත්ත ආදානය සහ ප්රතිදානය එක්සෙල් පැතුරුම්පතක් හරහා වේ.නියැදිය පමණි
මිශ්ර කිරීම අවශ්ය වේ, අනුක්රමණයක් නොමැත
පියවර අවශ්ය වේ:(උදාහරණයක් ලෙස Bole CFX96 ගන්න, පැහැදිලි ABI සහිත යන්ත්‍රයක් නොවේ)
අත්හදා බැලීම:එය සම්මත qPCR අත්හදා බැලීමකි.
qPCR දත්ත ප්රතිදානය:LinRegPCR හට ප්‍රතිදාන ගොනු ආකාර දෙකක් හඳුනාගත හැක: RDML හෝ ප්‍රමාණාත්මක විස්තාරණ ප්‍රතිඵලය.ඇත්ත වශයෙන්ම, එය යන්ත්රය මගින් චක්‍ර අංකය සහ ප්රතිදීප්ත සංඥාවේ තත්‍ය කාලීන හඳුනාගැනීමේ අගය වන අතර රේඛීය කොටසේ කාර්යක්ෂමතාවයේ ප්රතිදීප්ත වෙනස්වීම් අගය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් විස්තාරණය ලබා ගනී.
දත්ත තේරීම: න්‍යායාත්මකව, RDML අගය භාවිතා කළ හැකි විය යුතුය.මගේ පරිගණකයේ ගැටලුව වන්නේ මෘදුකාංගයට RDML හඳුනා ගැනීමට නොහැකි වීම බව ගණන් බලා ඇත, එබැවින් මුල් දත්ත ලෙස මා සතුව ඇත්තේ එක්සෙල් ප්‍රතිදාන අගයයි.නියැදි එකතු කිරීමේ අසාර්ථකත්වය වැනි දත්තවල දළ පිරික්සීමක් ප්‍රථමයෙන් සිදු කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ. ප්‍රතිදාන දත්තවල ලකුණු මකා දැමිය හැක (ඇත්ත වශයෙන්ම, ඔබට ඒවා මකා දැමිය නොහැක, LinRegPCR පසු අදියරේදී මෙම කරුණු නොසලකා හරිනු ඇත)
Fig5 qPCR දත්ත අපනයනය
Fig6 අපේක්ෂක සාම්පල තෝරාගැනීම
දත්ත ආදානය:විවෘත සුදුසුකම් විස්තාරණ results.xls, → විවෘත LinRegPCR → ගොනුව → excel වෙතින් කියවන්න → රූප සටහන 7 හි පෙන්වා ඇති පරිදි පරාමිති තෝරන්න → OK → මූලික රේඛා තීරණය කරන්න ක්ලික් කරන්න
linRegPCR දත්ත ආදානයේ Fig7 පියවර
ප්‍රතිඵලය:පුනරාවර්තනයක් නොමැති නම්, කණ්ඩායම් කිරීම අවශ්ය නොවේ.පුනරාවර්තනයක් තිබේ නම්, නියැදි කණ්ඩායම්කරණය තුළ කණ්ඩායම්කරණය සංස්කරණය කළ හැකි අතර, ජානයේ නම හඳුනාගැනීමේදී ඇතුළත් කර ඇති අතර, එම ජානය ස්වයංක්‍රීයව කාණ්ඩගත වේ.අවසාන වශයෙන්, ගොනුව මත ක්ලික් කරන්න, එක්සෙල් අපනයනය කරන්න, සහ ප්රතිඵල බලන්න.එක් එක් ළිඳෙහි විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සහ R2 ප්රතිඵල පෙන්වනු ඇත.දෙවනුව, ඔබ කණ්ඩායම් වලට බෙදුවහොත්, නිවැරදි කරන ලද සාමාන්ය විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව පෙන්වනු ඇත.එක් එක් ප්‍රාථමිකයේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 85% සහ 115% අතර බව සහතික කර ගන්න.එය ඉතා විශාල හෝ ඉතා කුඩා නම්, එයින් අදහස් වන්නේ ප්‍රාථමිකයේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව දුර්වල බවයි.
රූපය 8 ප්රතිඵල සහ දත්ත ප්රතිදානය
පර්යේෂණාත්මක ක්රියාවලිය:
RNA තත්ත්ව අවශ්‍යතා:
සංශුද්ධතාවය:1.72.0 මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ අවශේෂ isothiocyanate තිබිය හැකි බවයි.පිරිසිදු නියුක්ලික් අම්ලය A260/A230 2 පමණ විය යුතුය.230 nm දී ශක්තිමත් අවශෝෂණයක් තිබේ නම්, එය phenate අයන වැනි කාබනික සංයෝග ඇති බව පෙන්නුම් කරයි.මීට අමතරව, එය 1.5% agarose gel electrophoresis මගින් හඳුනාගත හැක.ssRNA හි denaturation නොමැති නිසා සහ අණුක බර ලඝුගණකයට රේඛීය සම්බන්ධතාවයක් නොමැති නිසාත්, අණුක බර නිවැරදිව ප්‍රකාශ කළ නොහැකි නිසාත් ලකුණුකරය යොමු කරන්න.සාන්ද්රණය: න්යායාත්මකවනැත100ng/ul ට වඩා අඩු, සාන්ද්රණය ඉතා අඩු නම්, සංශුද්ධතාවය සාමාන්‍යයෙන් අඩු උස නොවේ
Fig9 RNA ජෙල්
ඊට අමතරව, නියැදිය වටිනා නම් සහ RNA සාන්ද්රණය ඉහළ නම්, නිස්සාරණයෙන් පසු එය ඇල්කොට් කිරීම නිර්දේශ කරනු ලබන අතර, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා RNA අවසාන සාන්ද්රණය 100-300ng/ul දක්වා තනුක කරන්න.තුලප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්රියාවලිය, mRNA පිටපත් කරන විට, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා විශේෂයෙන් polyA ටේල් වලට බැඳිය හැකි oligo (dt) ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන අතර, lncRNA සහ circRNA මුළු RNA ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා අහඹු හෙක්සැමර් (Random 6 mer) ප්‍රයිමර් භාවිතා කරයි.බොහෝ සමාගම් දැන් විශේෂ tailing කට්ටල දියත් කර ඇත.කඳ-ලූප් ක්රමය සඳහා, ටේලිං ක්රමය වඩාත් පහසු, ඉහළ කාර්යක්‍ෂම සහ ප්‍රතික්‍රියාකාරක ඉතිරි කිරීම වේ, නමුත් එකම පවුලේ miRNA වෙන්කර හඳුනා ගැනීමේ බලපෑම කඳ-ලූප් ක්රමය තරම් හොඳ නොවිය යුතුය.සෑම ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කට්ටලයකම ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර් (කඳ-ලූප) සාන්ද්රණය සඳහා අවශ්‍යතා ඇත.miRNA සඳහා භාවිතා වන අභ්‍යන්තර යොමුව U6 වේ.කඳ-ලූප් ප්‍රතිලෝම කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී, U6 නලයක් වෙන වෙනම ආපසු හැරවිය යුතු අතර, U6 හි ඉදිරිපස සහ පසුපස ප්‍රාථමික සෘජුවම එකතු කළ යුතුය.CircRNA සහ lncRNA යන දෙකටම අභ්‍යන්තර යොමු ලෙස HKG භාවිතා කළ හැක.තුලcDNA හඳුනාගැනීම,
RNA සමඟ ගැටලුවක් නොමැති නම්, cDNA ද හොඳ විය යුතුය.කෙසේ වෙතත්, අත්හදා බැලීමේ පරිපූර්ණත්වය අනුගමනය කරන්නේ නම්, gDNA cd වලින් වෙන්කර හඳුනාගත හැකි අභ්‍යන්තර විමර්ශන ජානයක් (යොමු ජානය, RG) භාවිතා කිරීම වඩාත් සුදුසුය.සාමාන්‍යයෙන් RG යනු ගෘහ පාලනය කරන ජානයකි., HKG) රූපය 10 හි පෙන්වා ඇති පරිදි;ඒ වන විට මම සෝයා බෝංචි ගබඩා ප්‍රෝටීන් නිෂ්පාදනය කරමින් සිටි අතර අභ්‍යන්තර සඳහනක් ලෙස ඉන්ට්‍රෝන අඩංගු Actin7 භාවිතා කළෙමි.gDNA හි මෙම ප්‍රාථමිකයේ විස්තාරණය කළ කොටසෙහි ප්‍රමාණය 452bp වූ අතර cDNA අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කළේ නම් එය 142bp විය.ඉන්පසුව පරීක්ෂණ ප්රතිඵල මගින් cDNA හි කොටසක් gDNA මගින් ඇත්ත වශයෙන්ම අපවිත්‍ර වී ඇති බව සොයාගෙන ඇති අතර, එය ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතිඵලයේ කිසිදු ගැටළුවක් නොමැති බව ද ඔප්පු වී ඇති අතර, එය PCR සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කළ හැකිය.ඇගරෝස් ජෙල් විද්යුත් විච්ඡේදනය cDNA සමඟ සෘජුවම ක්‍රියාත්මක කිරීම නිෂ්ඵල වන අතර එය විසරණය වන පටියක් වන අතර එය ඒත්තු ගැන්විය නොහැක.
Figure 10 cDNA හඳුනාගැනීම
qPCR කොන්දේසි නිර්ණය කිරීමකට්ටලයේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුව සාමාන්‍යයෙන් ගැටළුවක් නැත, ප්‍රධාන වශයෙන් tm අගයේ පියවරේදී.සමහර ප්‍රයිමර් ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීමේදී හොඳින් සැලසුම් කර නොමැති නම්, tm අගය සහ සෛද්ධාන්තික 60°C අතර විශාල වෙනසක් ඇති වුවහොත්, cDNA සාම්පල මිශ්ර කළ පසු, ප්‍රයිමර් සමඟ Gradient PCR ධාවනය කර, TM අගය ලෙස කලාප නොමැතිව උෂ්ණත්වය සැකසීමෙන් වැළකී සිටීමට උත්සාහ කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.
දත්ත විශ්ලේෂණය
සාම්ප්‍රදායික සාපේක්ෂ ප්රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR සැකසුම් ක්රමය මූලික වශයෙන් 2 ට අනුව වේ.-ΔΔCT.දත්ත සැකසුම් අච්චුව.
ආශ්රිත නිෂ්පාදන:
රියල් ටයිම් PCR පහසුයිTM - තක්මාන්
රියල් ටයිම් PCR පහසුයිTM - සයිබර් ග්‍රීන් අයි
RT Easy I (පළමු කෙඳි cDNA සංස්ලේෂණය සඳහා Master Premix)
RT Easy II (qPCR සඳහා පළමු නූල් cDNA සංස්ලේෂණය සඳහා Master Premix)
පසු කාලය: මාර්තු-14-2023
