一, ප්රතික්රියා පද්ධතියේ සංවේදීතාව වැඩි කිරීම:

1. උසස් තත්ත්වයේ RNA හුදකලා කරන්න:

සාර්ථක cDNA සංස්ලේෂණය පැමිණෙන්නේ උසස් තත්ත්වයේ RNA වලින්.උසස් තත්ත්වයේ RNA අවම වශයෙන් සම්පූර්ණ දිග විය යුතු අතර EDTA හෝ SDS වැනි ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් නිෂේධකවලින් තොර විය යුතුය.RNA වල ගුණාත්මක භාවය ඔබට cDNA වෙත පිටපත් කළ හැකි උපරිම අනුක්‍රමික තොරතුරු ප්‍රමාණය තීරණය කරයි.සාමාන්‍ය RNA පිරිසිදු කිරීමේ ක්‍රමයක් යනු Guanidine isothiocyanate/acid phenol භාවිතා කරන එක්-පියවර ක්‍රමයකි.RNase හි අංශු මාත්‍රවලින් දූෂණය වීම වැලැක්වීම සඳහා, RNase බහුල සාම්පලවලින් (අග්න්‍යාශය වැනි) හුදකලා වූ RNA, විශේෂයෙන් දිගු කාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා, උසස් තත්ත්වයේ RNA සංරක්ෂණය කිරීම සඳහා formaldehyde තුළ ගබඩා කිරීම අවශ්‍ය වේ.මීයන්ගේ අක්මාවෙන් ලබාගත් RNA මූලික වශයෙන් සතියක් ජලයේ ගබඩා කිරීමෙන් පසු දිරාපත් වූ අතර මී ප්ලීහාවෙන් ලබාගත් RNA වසර 3 ක් ජලයේ ගබඩා කිරීමෙන් පසු ස්ථායීව පැවතුනි.මීට අමතරව, 4 kb ට වඩා දිගු පිටපත් කුඩා පිටපත් වලට වඩා ට්‍රේස් RNases මගින් පිරිහීමට වඩා සංවේදී වේ.ගබඩා කර ඇති RNA සාම්පලවල ස්ථායීතාවය වැඩි කිරීම සඳහා, RNA deionized formamide හි දියකර -70 ° C දී ගබඩා කළ හැක.ආර්එන්ඒ සංරක්ෂණය කිරීමට භාවිතා කරන ෆෝමමයිඩ් ආර්එන්ඒ-හායන සුන්බුන් වලින් තොර විය යුතුය.අග්න්‍යාශයෙන් ලැබෙන ආර්එන්ඒ අවම වශයෙන් වසරක්වත් ෆෝමයිඩ් වල සංරක්ෂණය කළ හැක.RNA භාවිතා කිරීමට සූදානම් වන විට, ඔබට RNA අවක්ෂේප කිරීමට පහත ක්‍රමය භාවිතා කළ හැක: NaCl 0.2M සහ එතනෝල් පරිමාව මෙන් 4 ගුණයක් එකතු කරන්න, කාමර උෂ්ණත්වයේ විනාඩි 3-5ක් තබන්න, සහ විනාඩි 5ක් සඳහා 10,000×g කේන්ද්‍රාපසාරී කරන්න.

2. RNaseH-අක්‍රිය (RNaseH-) ප්‍රතිලෝම පිටපත භාවිතා කරන්න

cDNA සංස්ලේෂණයේ දිග සහ අස්වැන්න වැඩි කිරීම සඳහා RNase inhibitors බොහෝ විට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියා වලට එකතු කරනු ලැබේ.RNase inhibitors බෆරයක් සහ අඩු කිරීමේ කාරකයක් (DTT වැනි) ඉදිරියේ පළමු තන්තු සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාවේදී එකතු කළ යුතුය, මන්ද cDNA සංස්ලේෂණයට පෙර ක්‍රියාවලිය නිෂේධකය නිෂේධනය කරයි, එමඟින් RNA හායනය කළ හැකි බැඳුනු RNase නිදහස් කරයි.ප්‍රෝටීන් RNase නිෂේධක RNase A, B, C මගින් RNA ක්ෂය වීම පමණක් වළක්වන අතර සම මත RNase වලක්වන්නේ නැත, එබැවින් මෙම නිෂේධක භාවිතා කළද ඔබේ ඇඟිලිවලින් RNase හඳුන්වා නොදීමට වගබලා ගන්න.

ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම RNA cDNA බවට පරිවර්තනය කිරීම උත්ප්‍රේරණය කරයි.M-MLV සහ AMV යන දෙකෙහිම ස්වකීය බහු අවයවීය ක්‍රියාකාරකම් වලට අමතරව ආවේණික RNaseH ක්‍රියාකාරකම් ඇත.RNaseH ක්‍රියාකාරකම් සහ පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරකම් RNA අච්චුව සහ DNA ප්‍රයිමරය හෝ cDNA විස්තාරණ තන්තුව අතර පිහිටුවා ඇති දෙමුහුන් නූල් සඳහා එකිනෙකා සමඟ තරඟ කරන අතර RNA:DNA සංකීර්ණයේ ඇති RNA තන්තුව පිරිහීමට ලක් කරයි.RNaseH ක්‍රියාකාරකම් මගින් පිරිහුණු RNA අච්චුව cDNA සංස්ලේෂණය සඳහා ඵලදායි උපස්ථරයක් ලෙස තවදුරටත් ක්‍රියා කළ නොහැක, එය cDNA සංස්ලේෂණයේ අස්වැන්න සහ දිග අඩු කරයි.එබැවින්, ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් හි RNaseH ක්‍රියාකාරකම් ඉවත් කිරීම හෝ විශාල වශයෙන් අඩු කිරීම ප්‍රයෝජනවත් වනු ඇත.

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් සහ තර්මෝස්ක්‍රිප්ට් ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස්, RNaseH- AMV, MMLV සහ AMV වලට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් සහ සම්පූර්ණ දිග cDNA ලබා ගත හැක.RT-PCR සංවේදීතාවයට cDNA සංස්ලේෂණයේ ප්‍රමාණය බලපානු ඇත.ThermoScript AMV වලට වඩා සංවේදීයි.RT-PCR නිෂ්පාදනවල ප්‍රමාණය සීමා වන්නේ cDNA සංස්ලේෂණය කිරීමට ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් වලට ඇති හැකියාව මගිනි, විශේෂයෙන් විශාල cDNA ක්ලෝන කරන විට.MMLV හා සසඳන විට, SuperScripⅡ දිගු RT-PCR නිෂ්පාදනවල අස්වැන්න සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි කළේය.RNaseH-ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් ද තාප ස්ථායීතාවය වැඩි කර ඇත, එබැවින් සාමාන්‍ය 37-42 ° C ට වඩා වැඩි උෂ්ණත්වයකදී ප්‍රතික්‍රියාව සිදු කළ හැකිය.යෝජිත සංශ්ලේෂණ කොන්දේසි යටතේ, ඔලිගෝ(dT) ප්‍රාථමිකය සහ [α-P]dCTP හි 10 μCi භාවිතා කරන්න.TCA වර්ෂාපතන ක්‍රමය භාවිතයෙන් පළමු කෙඳිවල සම්පූර්ණ අස්වැන්න ගණනය කරන ලදී.සම්පූර්ණ දිග cDNA විශ්ලේෂණය කරන ලද්දේ ප්‍රමාණයෙන් වර්ග කළ පටි භාවිතයෙන් ඉවත් කර ක්ෂාරීය ඇගරෝස් ජෙල් මත ගණන් කරමිනි.

3. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා ඉන්කියුබේෂන් උෂ්ණත්වය ඉහළ නැංවීම:

ඉහළ ඉන්කියුබේෂන් උෂ්ණත්වය RNA ද්විතියික ව්‍යුහය විවෘත කිරීමට උපකාරී වන අතර ප්‍රතික්‍රියාවේ අස්වැන්න වැඩි කරයි.බොහෝ RNA සැකිලි සඳහා, බෆරය හෝ ලුණු නොමැතිව 65 ° C දී RNA සහ ප්‍රයිමර් ඉන්කියුබේට් කිරීම, පසුව අයිස් මත වේගවත් සිසිලනය බොහෝ ද්විතියික ව්‍යුහයන් ඉවත් කර ප්‍රයිමර් බැඳීමට ඉඩ සලසයි.කෙසේ වෙතත්, සමහර සැකිලි තවමත් තාප පිරිහීමෙන් පසුව පවා ද්විතියික ව්යුහයන් ඇත.මෙම දුෂ්කර සැකිලි වල විස්තාරණය ThermoScript ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් භාවිතයෙන් සිදු කළ හැකි අතර විස්තාරණය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාව ඉහළ උෂ්ණත්වයක තැබීම.විශේෂයෙන් cDNA සංස්ලේෂණය සඳහා ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර් (GSP) භාවිතා කරන විට, වැඩි ඉන්කියුබේෂන් උෂ්ණත්වයන් විශේෂත්වය වැඩි කළ හැක (3 වන පරිච්ඡේදය බලන්න).GSP භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රයිමර් වල Tm අපේක්ෂිත ඉන්කියුබේෂන් උෂ්ණත්වයට සමාන බව සහතික කර ගන්න.60°C ට වැඩි ඔලිගෝ(dT) සහ අහඹු ප්‍රයිමර් භාවිතා නොකරන්න.අහඹු ප්‍රයිමර් 60 ° C දක්වා වැඩි කිරීමට පෙර විනාඩි 10 ක් 25 ° C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම අවශ්‍ය වේ.ඉහළ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ උෂ්ණත්වයක් භාවිතා කිරීමට අමතරව, RNA/primer මිශ්‍රණය 65°C denaturation උෂ්ණත්වයේ සිට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ඉන්කියුබේෂන් උෂ්ණත්වයට සෘජුවම මාරු කිරීමෙන් සහ පෙර-උණුසුම් වූ 2× ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයක් (cDNA උණුසුම්-ආරම්භක සංශ්ලේෂණය) එකතු කිරීමෙන්ද විශේෂත්වය වැඩි දියුණු කළ හැක.මෙම ප්‍රවේශය අඩු උෂ්ණත්වවලදී සිදුවන අන්තර් අණුක පාද යුගලය වැලැක්වීමට උපකාරී වේ.RT-PCR සඳහා අවශ්‍ය බහුවිධ උෂ්ණත්ව මාරු කිරීම තාප චක්‍රයක් භාවිතයෙන් සරල කළ හැක.

Tth තාප ස්ථායී පොලිමරේස් Mg2+ ඉදිරියේ DNA පොලිමරේස් ලෙසත් Mn2+ ඉදිරියේ RNA පොලිමරේස් ලෙසත් ක්‍රියා කරයි.එය උපරිම උෂ්ණත්වය 65 ° C දී උණුසුම්ව තබා ගත හැකිය.කෙසේ වෙතත්, PCR තුළ Mn2+ පැවතීම විශ්වාසවන්තභාවය අඩු කරයි, එමඟින් Tth පොලිමරේස් cDNA ක්ලෝන කිරීම වැනි ඉහළ නිරවද්‍ය විස්තාරණය සඳහා සුදුසු නොවේ.ඊට අමතරව, Tth හි අඩු ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාවයක් ඇති අතර, එය සංවේදීතාව අඩු කරයි, සහ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ PCR තනි එන්සයිමයකින් සිදු කළ හැකි බැවින්, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමකින් තොරව පාලන ප්‍රතික්‍රියා cDNA විස්තාරණ නිෂ්පාදන දූෂිත ජානමය DNA සමඟ සංසන්දනය කිරීමට භාවිතා කළ නොහැක.වර්ධක නිෂ්පාදන වෙන් කර ඇත.

4. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම ප්‍රවර්ධනය කරන ආකලන:

ග්ලිසරෝල් සහ ඩීඑම්එස්ඕ ඇතුළු ආකලන පළමු නූල් සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාවට එකතු කරන අතර එමඟින් න්‍යෂ්ටික අම්ල ද්විත්ව නූල්වල ස්ථායීතාවය අඩු කළ හැකි අතර RNA හි ද්විතියික ව්‍යුහය ලිහා දැමිය හැකිය.SuperScript II හෝ MMLV ක්‍රියාකාරකමට බලපෑම් නොකර 20% glycerol හෝ 10% DMSO එකතු කළ හැක.AMV හට ක්‍රියාකාරීත්වය නැතිවීමකින් තොරව 20% දක්වා ග්ලිසරෝල් ඉවසිය හැක.SuperScriptⅡ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාවේ දී RT-PCR හි සංවේදීතාව උපරිම කිරීම සඳහා, 10% glycerol එකතු කර 45°C දී පුර්වගත කළ හැක.ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියා නිෂ්පාදනයෙන් 1/10 ක් PCR වෙත එකතු කළහොත්, විස්තාරණ ප්‍රතික්‍රියාවේ ග්ලිසරෝල් සාන්ද්‍රණය 0.4% වන අතර එය PCR නිෂේධනය කිරීමට ප්‍රමාණවත් නොවේ.

5. RNaseH ප්රතිකාර:

PCR වලට පෙර RNaseH සමඟ cDNA සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියා වලට ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් සංවේදීතාව වැඩි කළ හැක.සමහර සැකිලි සඳහා, cDNA සංස්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාවේ RNA විස්තාරණ නිෂ්පාදන බන්ධනය වීම වළක්වන බව විශ්වාස කෙරේ, මෙම අවස්ථාවේදී RNaseH ප්‍රතිකාරය සංවේදීතාව වැඩි කළ හැකිය.සාමාන්‍යයෙන්, අඩු පිටපත් ටියුබෙරස් ෂෙරෝසිස් II වැනි දිගු පූර්ණ-දිග cDNA ඉලක්ක සැකිලි විස්තාරණය කිරීමේදී RNaseH ප්‍රතිකාරය අවශ්‍ය වේ.මෙම දුෂ්කර අච්චුව සඳහා, RNaseH ප්‍රතිකාරය SuperScript II හෝ AMV-සංශ්ලේෂණය කරන ලද cDNA මගින් නිපදවන ලද සංඥාව වැඩිදියුණු කරන ලදී.බොහෝ RT-PCR ප්‍රතික්‍රියා සඳහා, RNaseH ප්‍රතිකාරය වෛකල්පිත වේ, මන්ද PCR denaturation පියවර 95 ° C සාමාන්‍යයෙන් RNA:DNA සංකීර්ණයේ RNA ජල විච්ඡේදනය කරයි.

6. කුඩා RNA හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමය වැඩිදියුණු කිරීම:

RNA කුඩා ප්‍රමාණයක් පමණක් පවතින විට RT-PCR විශේෂයෙන් අභියෝගාත්මක වේ.RNA හුදකලා කිරීමේදී වාහකයක් ලෙස එකතු කරන ලද Glycogen කුඩා සාම්පලවල අස්වැන්න වැඩි කිරීමට උපකාරී වේ.ට්‍රයිසෝල් එකතු කරන අවස්ථාවේදීම RNase-free glycogen එකතු කළ හැක.Glycogen ජලයේ ද්‍රාව්‍ය වන අතර පසුව වර්ෂාපතනය සඳහා ආධාර කිරීම සඳහා RNA සමඟ ජලීය අවධියේ තබා ගත හැක.පටක මිලිග්‍රෑම් 50 ට අඩු හෝ සංස්කෘත සෛල 106 ට අඩු සාම්පල සඳහා, RNase-free glycogen හි නිර්දේශිත සාන්ද්‍රණය 250 μg/ml වේ.

SuperScript II භාවිතයෙන් ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාවට acetylated BSA එකතු කිරීමෙන් සංවේදීතාව වැඩි කළ හැකි අතර, RNA කුඩා ප්‍රමාණයන් සඳහා SuperScript II ප්‍රමාණය අඩු කිරීමෙන් සහ RNaseOut nuclease inhibitor ඒකක 40ක් එකතු කිරීමෙන් හඳුනාගැනීමේ මට්ටම වැඩි කළ හැක.RNA හුදකලා කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී glycogen භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා SuperScript II භාවිතා කරන විට BSA හෝ RNase inhibitor එකතු කිරීම තවමත් නිර්දේශ කෙරේ.

RT-PCR විශේෂත්වය වැඩි කරන්න

1. CND අසමමිතිය

පළමු තන්තු cDNA සංස්ලේෂණය විවිධ ක්‍රම තුනක් භාවිතයෙන් ආරම්භ කළ හැක, එහි සාපේක්ෂ නිශ්චිතතාවය සංස්ලේෂණය කරන ලද cDNA ප්‍රමාණයට සහ වර්ගයට බලපායි.

සසම්භාවී ප්‍රාථමික ක්‍රමය ක්‍රම තුනෙන් අවම වශයෙන් විශේෂිත විය.කෙටි, අර්ධ-දිග cDNA ජනනය කරමින්, පිටපත පුරා බහුවිධ අඩවිවල ප්‍රයිමර් ඇනීල් කරයි.මෙම ක්‍රමය 5′ අවසන් අනුපිළිවෙල ලබා ගැනීමට සහ ද්විතියික ව්‍යුහයේ කලාප සහිත හෝ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම මගින් ප්‍රතිවර්තනය කළ නොහැකි අවසන් ස්ථාන සහිත RNA සැකිලි වලින් cDNA ලබා ගැනීමට නිතර භාවිතා වේ.දිගම cDNA ලබා ගැනීම සඳහා, එක් එක් RNA සාම්පලයේ ප්‍රයිමර් සහ RNA අනුපාතය ආනුභවිකව තීරණය කළ යුතුය.සසම්භාවී ප්‍රාථමික වල ආරම්භක සාන්ද්‍රණය 20 μl ප්‍රතික්‍රියාවකට 50 සිට 250 ng දක්වා පරාසයක පවතී.සසම්භාවී ප්‍රාථමික භාවිතයෙන් සම්පූර්ණ RNA වලින් සංස්ලේෂණය කරන ලද cDNA මූලික වශයෙන් ribosomal RNA වන බැවින්, poly(A)+RNA සාමාන්‍යයෙන් අච්චුව ලෙස තෝරා ගැනේ.

Oligo(dT) ප්‍රයිමර් අහඹු ප්‍රයිමර් වලට වඩා විශේෂිත වේ.එය බොහෝ යුකැරියෝටික් mRNA වල 3′ අන්තයේ ඇති පොලි(A) වලිගයට දෙමුහුන් වේ.Poly(A)+ RNA මුළු RNA වලින් 1% සිට 2% දක්වා වන නිසා cDNA ප්‍රමාණය සහ සංකීර්ණත්වය අහඹු ප්‍රයිමර් වලට වඩා බෙහෙවින් අඩුය.එහි ඉහළ විශේෂත්වය නිසා, oligo(dT) සඳහා සාමාන්‍යයෙන් RNA අනුපාතය ප්‍රයිමර් සහ poly(A)+ තේරීම ප්‍රශස්ත කිරීම අවශ්‍ය නොවේ.20μl ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියකට 0.5μg ඔලිගෝ (dT) භාවිතා කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.oligo(dT)12-18 බොහෝ RT-PCR සඳහා සුදුසු වේ.ThermoScript RT-PCR පද්ධතිය oligo(dT)20 ලබා දෙන්නේ එහි වැඩි පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු උෂ්ණත්වයන් සඳහා එහි වඩා හොඳ තාප ස්ථායීතාවය නිසාය.

ජාන විශේෂිත ප්‍රයිමර් (GSP) යනු ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පියවර සඳහා වඩාත් විශේෂිත ප්‍රයිමර් වේ.ජීඑස්පී යනු සසම්භාවී ප්‍රයිමර් හෝ ඔලිගෝ (ඩීටී) මෙන් නොව සියලුම ආර්එන්ඒ වලට අනුවර්තනය වන ආර්එන්ඒ ඉලක්ක අනුපිළිවෙලට විශේෂයෙන් දෙමුහුන් කළ හැකි ප්‍රතිදේහ ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩයකි.PCR ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීම සඳහා භාවිතා කරන එම නීති ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියා වලදී GSP නිර්මාණය සඳහාද අදාළ වේ.GSP යනු mRNA හි 3′-වැඩිම අන්තයට අනුවර්තනය වන වර්ධක ප්‍රාථමිකය හා සමාන අනුපිළිවෙලක් විය හැකිය, නැතහොත් GSP ප්‍රතිලෝම විස්තාරණ ප්‍රාථමිකයේ පහළ ප්‍රවාහයට විවර කිරීමට සැලසුම් කළ හැකිය.සමහර විස්තාරණය කරන ලද විෂයයන් සඳහා, ඉලක්කගත RNA හි ද්විතියික ව්‍යුහය ප්‍රාථමික බන්ධනය වැළැක්විය හැකි නිසා සාර්ථක RT-PCR සඳහා ප්‍රතිදේහ ප්‍රයිමර එකකට වඩා සැලසුම් කළ යුතුය.20 μl පළමු කෙඳි සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාවක දී 1 pmol antisense GSP භාවිතා කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.

2. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා ඉන්කියුබේෂන් උෂ්ණත්වය ඉහළ නැංවීම:

ජීඑස්පී විශේෂත්වයේ සම්පූර්ණ වාසියෙන් උපරිම ප්‍රයෝජන ගැනීම සඳහා, ඉහළ තාප ස්ථායීතාවයක් සහිත ප්‍රතිලෝම පිටපතක් භාවිතා කළ යුතුය.ප්‍රතික්‍රියා තද බව වැඩි කිරීම සඳහා තාප ස්ථායී ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් ඉහළ උෂ්ණත්වවලදී පුර්වගත කළ හැක.උදාහරණයක් ලෙස, GSP එකක් 55°C දී ඇනීල් නම්, 37°C හි අඩු තද ගතියකදී ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා AMV හෝ M-MLV භාවිතා කරන්නේ නම්, GSP හි නිශ්චිතභාවය සම්පූර්ණයෙන් භාවිත නොවනු ඇත.කෙසේ වෙතත්, SuperScript II සහ ThermoScript 50 ° C හෝ ඊට වැඩි උෂ්ණත්වයකදී ප්‍රතික්‍රියා කළ හැකි අතර, එමඟින් අඩු උෂ්ණත්වවලදී ජනනය වන විශේෂිත නොවන නිෂ්පාදන ඉවත් කරනු ඇත.උපරිම නිශ්චිතභාවය සඳහා, RNA/primer මිශ්‍රණය 65°C denaturation උෂ්ණත්වයේ සිට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ඉන්කියුබේෂන් උෂ්ණත්වයට සෘජුවම මාරු කළ හැකි අතර පෙර-උණුසුම් වූ 2× ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයකට (cDNA සංස්ලේෂණය උණුසුම් ආරම්භය) එක් කළ හැක.මෙය අඩු උෂ්ණත්වවලදී අන්තර් අණුක පාද යුගලනය වැලැක්වීමට උපකාරී වේ.RT-PCR සඳහා අවශ්‍ය බහුවිධ උෂ්ණත්ව සංක්‍රාන්ති තාප චක්‍රයක් භාවිතයෙන් සරල කළ හැක.

3. ජානමය DNA දූෂණය අඩු කරයි

RT-PCR සමඟ ඇති විය හැකි දුෂ්කරතාවයක් වන්නේ RNA හි ඇති ජානමය DNA දූෂණය වීමයි.ට්‍රයිසෝල් ප්‍රතික්‍රියාකාරක වැනි හොඳ RNA හුදකලා ක්‍රමයක් භාවිතා කිරීමෙන් RNA සකස් කිරීම දූෂණය කරන ප්‍රවේණික DNA ප්‍රමාණය අඩු කරනු ඇත.ප්‍රවේණි DNA වලින් ලබාගත් නිෂ්පාදන වලක්වා ගැනීම සඳහා, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමට පෙර දූෂිත DNA ඉවත් කිරීමට RNA විස්තාරණ ශ්‍රේණියේ DNase I සමඟ ප්‍රතිකාර කළ හැක.65°C දී මිනිත්තු 10ක් 2.0 mM EDTA තුළ සාම්පල පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම මගින් DNase I ජීර්ණය අවසන් විය.EDTA හට මැග්නීසියම් අයන chelate කළ හැකි අතර, ඉහළ උෂ්ණත්වවලදී මැග්නීසියම් අයන මත යැපෙන RNA ජල විච්ඡේදනය වළක්වයි.

අපිරිසිදු ජානමය DNA විස්තාරණ නිෂ්පාදන වලින් විස්තාරණය කරන ලද cDNA වෙන් කිරීම සඳහා, එක් එක් exons වෙන් කිරීම සඳහා ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කළ හැකිය.cDNA වලින් ලබාගත් PCR නිෂ්පාදන දූෂිත ජානමය DNA වලින් ලබාගත් ඒවාට වඩා කෙටි වේ.මීට අමතරව, ලබා දී ඇති කැබැල්ලක් ප්‍රවේණික DNA හෝ cDNA වලින් ව්‍යුත්පන්න වී ඇත්ද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා එක් එක් RNA අච්චුව මත ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමකින් තොරව පාලන පරීක්ෂණයක් සිදු කරන ලදී.ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමකින් තොරව ලබාගත් PCR නිෂ්පාදනය ජෙනෝමයෙන් ව්‍යුත්පන්න වේ.