Ⅰ. ප්රතික්රියා පද්ධතියේ සංවේදීතාව වැඩි කරන්න:

1. වෙනම උසස් තත්ත්වයේ RNA:

සාර්ථක cDNA සංස්ලේෂණය පැමිණෙන්නේ උසස් තත්ත්වයේ RNA වලින්.උසස් තත්ත්වයේ RNA අවම වශයෙන් සම්පූර්ණ දිගු කාලයක් සහතික කළ යුතු අතර EDTA හෝ SDS වැනි පටිගත කිරීමේ එන්සයිම අඩංගු නොවන නිෂේධක අඩංගු නොවේ.RNA වල ගුණාත්මක භාවය ඔබට cDNA වෙත පිටපත් කළ හැකි අනුක්‍රමික තොරතුරුවල උපරිම අගය තීරණය කරයි.සාමාන්‍ය RNA පිරිසිදු කිරීමේ ක්‍රමය isoocyanate/acidophenol භාවිතා කිරීමේ පියවර ක්‍රමයකි.RNase දූෂණය වැලැක්වීම සඳහා, RNase (අග්න්‍යාශය වැනි) බහුල සාම්පලයකින් වෙන් කරන ලද RNA හට උසස් තත්ත්වයේ RNA සුරැකීමට formaldehyde ගබඩා කිරීම අවශ්‍ය වේ, එය දිගුකාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා ඊටත් වඩා වැඩිය.මීයන්ගේ අක්මාවෙන් ලබාගත් RNA මූලික වශයෙන් ජලයේ ගබඩා කිරීමෙන් සතියකට පසු ක්ෂය වී ඇති අතර මී ප්ලීහාවෙන් ලබාගත් RNA වසර තුනක ජලයේ ගබඩා කිරීමෙන් පසුව ස්ථායීව පවතී.මීට අමතරව, 4kb ට වඩා විශාල පිටපත් කුඩා පිටපත් වලට වඩා RNase හායනය සොයා ගැනීමට සංවේදී වේ.ගබඩා RNA සාම්පලයේ ස්ථායීතාව වැඩි කිරීම සඳහා, RNA අයන මෙතල්මමයින් තුළ දියකර -70 °C ගබඩා කර ඇත.RNA සුරැකීමට භාවිතා කරන තයිලයිඩ් වල RNA හායනය කරන විවිධ වස්තුවක් අඩංගු නොවිය යුතුය.අග්න්‍යාශයෙන් ලබාගත් ආර්එන්ඒ, අවම වශයෙන් වසරක්වත් මෙතල්මමින් වල ඉතිරි කර ගත හැක.ඔබ RNA භාවිතා කිරීමට සූදානම් වන විට, ඔබට RNA අවක්ෂේප කිරීමට පහත ක්‍රම භාවිතා කළ හැක: NaCl 0.2m සහ එතනෝල් පරිමාව මෙන් 4 ගුණයක් එකතු කරන්න, කාමර උෂ්ණත්වය විනාඩි 3-5ක් තබන්න, සහ විනාඩි 5ක් සඳහා 10,000 × g කේන්ද්‍රාපසාරී කරන්න.

2. RNaseH ක්‍රියාකාරකමකින් තොරව (RNaseH-) ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම භාවිතා කරන්න:

cDNA සංස්ලේෂණයේ දිග සහ අස්වැන්න වැඩි කිරීම සඳහා RNase inhibitors බොහෝ විට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියා වලට එකතු කරනු ලැබේ.RNase inhibitor ප්‍රථම දාම සංස්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාවේදී බෆර සහ DTT වැනි අඩු කිරීමේ කාරක හමුවේ එකතු කරනු ලබන්නේ පූර්ව cDNA සංස්ලේෂණ ක්‍රියාවලිය නිෂේධකය නිෂේධනය කරයි, එමගින් RNA හායනය කරන බැඳුනු RNases මුදා හැරීම නිසාය.ප්‍රෝටීන් RNase inhibitor මගින් RNase A, B, C මගින් RNA ක්ෂය වීම පමණක් වළක්වන අතර සම මත RNases ඇතිවීම වළක්වන්නේ නැත, එබැවින් මෙම නිෂේධක භාවිතා කළද ඇඟිලිවලින් RNases හඳුන්වා නොදීමට වගබලා ගත යුතුය.

ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් RNA cDNA බවට පරිවර්තනය කිරීම උත්ප්‍රේරණය කරයි.M-MLV සහ AMV යන දෙකෙහිම ස්වකීය බහු අවයවීය ක්‍රියාකාරකම් වලට අමතරව ආවේණික RNaseH ක්‍රියාකාරකම් ඇත.RNaseH ක්‍රියාකාරකම් RNA සැකිලි සහ DNA ප්‍රයිමර් හෝ cDNA විස්තාරණ කෙඳි අතර පිහිටුවා ඇති විෂම තන්තු සඳහා පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරකම් සමඟ තරඟ කරන අතර DNA සංකීර්ණවල RNA: RNA කෙඳි පිරිහීමට ලක් කරයි.RNaseH ක්‍රියාකාරකම් මගින් පිරිහුණු RNA සැකිලි cDNA සංස්ලේෂණය සඳහා ඵලදායී උපස්ථර ලෙස තවදුරටත් භාවිතා කළ නොහැක, cDNA සංස්ලේෂණයේ අස්වැන්න සහ දිග අඩු කරයි.මෙලෙස ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් හි RNaseH ක්‍රියාකාරකම් ඉවත් කිරීම හෝ විශාල වශයෙන් අඩු කිරීම විශාල ප්‍රයෝජනයක් වනු ඇත.

SuperScriptⅡ ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස්, RNaseH- හි MMLV ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් සහ ThermoScript ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස්, RNaseH- හි AMV MMLV සහ AMV වලට වඩා පූර්ණ-දිග cDNA ලබා දුන්නේය.RT-PCR සංවේදීතාවයට cDNA සංස්ලේෂණය කරන ලද ප්‍රමාණය බලපායි.ThermoScript AMV වලට වඩා සංවේදීයි.RT-PCR නිෂ්පාදනවල ප්‍රමාණය සීමා වන්නේ cDNA සංස්ලේෂණය කිරීමට ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේසයට ඇති හැකියාව මගිනි, විශේෂයෙන්ම විශාල Cdnas ක්ලෝන කරන විට.MMLV හා සසඳන විට, SuperScripⅡ දිගු RT-PCR නිෂ්පාදනවල අස්වැන්න සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි කළේය.RNaseH- හි ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් තාප ස්ථායීතාවය වැඩි කරයි, එබැවින් ප්‍රතික්‍රියාව සාමාන්‍ය 37-42℃ ට වඩා වැඩි උෂ්ණත්වවලදී සිදු කළ හැක.යෝජිත සංශ්ලේෂණ තත්ව යටතේ, oligo(dT) ප්‍රයිමර් සහ 10μCi [alpha-p]dCTP භාවිතා කරන ලදී.පළමු දාමයේ සම්පූර්ණ නිෂ්පාදනය TCA වර්ෂාපතන ක්‍රමය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී.සම්පූර්ණ දිග cDNA ප්‍රමාණයෙන් වර්ග කළ තීරු ඉවත් කිරීම සහ ක්ෂාරීය ඇගරෝස් ජෙල් තුළ ගණන් කිරීම භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.

3. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ තාප සංරක්ෂණ උෂ්ණත්වය වැඩි කරන්න

RNA හි ද්විතියික ව්‍යුහය විවෘත කිරීමට සහ ප්‍රතික්‍රියාවේ අස්වැන්න වැඩි කිරීමට ඉහළ රඳවා ගැනීමේ උෂ්ණත්වය උපකාරී වේ.බොහෝ RNA සැකිලි සඳහා, බෆරය හෝ ලුණු නොමැතිව 65 ° C දී RNA සහ ප්‍රයිමරය රඳවා තබාගෙන පසුව අයිස් මත ඉක්මනින් සිසිල් කිරීම බොහෝ ද්විතියික ව්‍යුහයන් ඉවත් කර ප්‍රයිමර් බැඳීමට ඉඩ සලසයි.කෙසේ වෙතත්, සමහර සැකිලි තවමත් තාප පිරිහීමෙන් පසුව පවා ද්විතියික ව්යුහය ඇත.මෙම දුෂ්කර සැකිලි වල විස්තාරණය ThermoScript ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් භාවිතයෙන් සහ විස්තාරණය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් ප්‍රතික්‍රියාව ඉහළ උෂ්ණත්වවල තැබීමෙන් සිදු කළ හැක.විශේෂයෙන් ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර් (GSPS) භාවිතයෙන් cDNA සංස්ලේෂණය සිදු කරන විට, ඉහළ රඳවා ගැනීමේ උෂ්ණත්වයන් විශේෂත්වය වැඩි කළ හැක (3 වන පරිච්ඡේදය බලන්න).GSP භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රයිමරයේ Tm අගය අපේක්ෂිත රඳවා ගැනීමේ උෂ්ණත්වයට සමාන බව සහතික කර ගන්න.60℃ ට වැඩි ඔලිගෝ(dT) සහ සසම්භාවී ප්‍රයිමර් භාවිතා නොකරන්න.සසම්භාවී ප්‍රයිමර් 60℃ දක්වා වැඩි කිරීමට පෙර විනාඩි 10 ක් 25℃ හි තබා ගත යුතුය.ඉහළ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ උෂ්ණත්වයන් භාවිතා කිරීමට අමතරව, RNA/ප්‍රයිමර් මිශ්‍රණය 65℃ denaturing උෂ්ණත්වයේ සිට ප්‍රතිලෝම පිටපත් රඳවන උෂ්ණත්වයට සෘජුවම මාරු කිරීමෙන් සහ පෙර රත් කළ 2× ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයක් (cDNA තාප ආරම්භක සංස්ලේෂණය) එකතු කිරීමෙන් විශේෂත්වය වැඩි දියුණු කළ හැක.මෙම ප්‍රවේශය අඩු උෂ්ණත්වවලදී සිදුවන අන්තර් අණුක පාද යුගලය වැලැක්වීමට උපකාරී වේ.PCR උපකරණයක් භාවිතා කිරීම RT-PCR සඳහා අවශ්ය බොහෝ උෂ්ණත්ව ස්විචයන් සරල කරයි.

Tth තාප ස්ථායී පොලිමරේස් Mg2+ ඉදිරියේ DNA පොලිමරේස් ලෙසත් Mn2+ ඉදිරියේ RNA පොලිමරේස් ලෙසත් ක්‍රියා කරයි.එය සෙල්සියස් අංශක 65 දක්වා තාපය රඳවා ගත හැකිය.කෙසේ වෙතත්, PCR තුළ Mn2+ පැවතීම විශ්වාසවන්තභාවය අඩු කරයි, එමඟින් Tth පොලිමරේස් cDNA ක්ලෝනකරණය වැනි ඉහළ නිරවද්‍යතා විස්තාරණය සඳහා සුදුසු නොවේ.මීට අමතරව, Tth ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේදී අඩු කාර්යක්‍ෂමතාවයක් ඇති අතර, එය සංවේදීතාව අඩු කරයි, සහ තනි එන්සයිමයකට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ PCR සිදු කළ හැකි බැවින්, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමකින් තොරව පාලන ප්‍රතික්‍රියා මගින් cDNA හි වර්ධිත නිෂ්පාදන දූෂිත ප්‍රවේණික DNA වලින් වෙන්කර හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කළ නොහැක.

4. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම ප්‍රවර්ධනය කරන ආකලන:

පළමු දාම සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාවට ග්ලිසරින් සහ ඩීඑම්එස්ඕ ඇතුළු ආකලන එකතු කිරීමෙන් න්‍යෂ්ටික අම්ල ද්විත්ව නූල්වල ස්ථායීතාවය අඩු කර RNA ද්විතියික ව්‍යුහය ලිහිල් කළ හැකිය.SuperScriptⅡ හෝ MMLV වල ක්‍රියාකාරීත්වයට බලපෑමක් නොකර 20% glycerin හෝ 10% DMSO එකතු කළ හැක.AMV හට ක්‍රියාකාරීත්වය අඩු නොකර 20% දක්වා ග්ලිසරෝල් ඉවසිය හැක.SuperScriptⅡ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාවේ RT-PCR හි සංවේදීතාව උපරිම කිරීම සඳහා, 10% glycerol එකතු කර 45℃ දී පරිවරණය කළ හැක.ප්‍රතිවර්තන-ප්‍රතික්‍රියා නිෂ්පාදනයෙන් 1/10 PCR වෙත එකතු කළහොත්, විස්තාරණ ප්‍රතික්‍රියාවේ ග්ලිසරෝල් සාන්ද්‍රණය 0.4% වන අතර එය PCR නිෂේධනය කිරීමට ප්‍රමාණවත් නොවේ.

5. RNaseH සැකසීම:

PCR වලට පෙර RNaseH සමඟ cDNA සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියා වලට ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් සංවේදීතාව වැඩි දියුණු කළ හැක.සමහර සැකිලි සඳහා, cDNA සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියාවේ ඇති RNA මගින් විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදන බන්ධනය වීම වළක්වන බව විශ්වාස කෙරේ, මෙම අවස්ථාවේදී RNaseH ප්‍රතිකාරය මගින් සංවේදීතාව වැඩි කළ හැක.සාමාන්‍යයෙන්, අඩු පිටපතක් සහිත tuberous scherosisⅡ වැනි සාපේක්ෂ දිගු පූර්ණ-දිග cDNA ඉලක්ක අච්චුවක විස්තාරණය සඳහා RNaseH ප්‍රතිකාරය අවශ්‍ය වේ.මෙම දුෂ්කර අච්චුව සඳහා, SuperScriptⅡ හෝ AMV මගින් සංස්ලේෂණය කරන ලද cDNA මගින් ජනනය කරන ලද සංඥාව RNaseH විසින් වැඩි දියුණු කරන ලදී.බොහෝ RT-PCR ප්‍රතික්‍රියා සඳහා, RNaseH ප්‍රතිකාරය විකල්ප නොවේ, මන්ද 95℃ පරිවරණය කරන ලද PCR denaturation පියවර සාමාන්‍යයෙන් RNA: DNA සංකීර්ණයෙන් RNA ජල විච්ඡේදනය කරයි.

6. කුඩා ප්‍රමාණයේ RNA හඳුනාගැනීම සඳහා වැඩි දියුණු කළ ක්‍රම:

RNA කුඩා ප්‍රමාණයක් පමණක් පවතින විට RT-PCR විශේෂයෙන් අභියෝගාත්මක වේ.RNA වෙන් කිරීමේදී වාහකයක් ලෙස ග්ලයිකෝජන් එකතු කිරීම කුඩා සාම්පලවල අස්වැන්න වැඩි කිරීමට උපකාරී වේ.ට්‍රයිසෝල් සමඟම RNase-නිදහස් ග්ලයිකෝජන් එකතු කළ හැක.Glycogen ජලයේ ද්‍රාව්‍ය වන අතර පසුව වර්ෂාපතනය සඳහා සහාය වීම සඳහා RNA සමඟ ජල අවධියේ පැවතිය හැක.RNase-free glycogen හි නිර්දේශිත සාන්ද්‍රණය 250μg/ml වේ නියැදි 50mg ට අඩු පටක හෝ 106 වගා සෛල සඳහා.

SuperScriptⅡ භාවිතයෙන් ප්‍රතිවර්තන ප්‍රතික්‍රියා වලට acetylated BSA එකතු කිරීම මගින් සංවේදීතාව වැඩි කළ හැකි අතර, RNA කුඩා ප්‍රමාණ සඳහා SuperScriptⅡ ප්‍රමාණය අඩු කිරීම සහ RnaseOut nuclease inhibitor ඒකක 40ක් එකතු කිරීම මගින් හඳුනාගැනීමේ මට්ටම වැඩිදියුණු කළ හැක.RNA වෙන් කිරීමේදී glycogen භාවිතා කරන්නේ නම්, SuperScriptⅡ භාවිතයෙන් පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියා ප්‍රතිලෝම කිරීමට BSA හෝ RNase inhibitors එකතු කිරීම තවමත් නිර්දේශ කෙරේ.

Ⅱ. RT-PCR හි විශේෂත්වය වැඩි කරන්න

1. cNDA සංශ්ලේෂණය

පළමු කෙඳි cDNA සංස්ලේෂණය ආරම්භ කිරීම සඳහා විවිධ ක්‍රම තුනක් භාවිතා කළ හැකි අතර, එක් එක් ක්‍රමයේ සාපේක්ෂ විශේෂත්වය cDNA සංස්ලේෂණය කරන ලද ප්‍රමාණයට සහ වර්ගයට බලපායි.

සසම්භාවී ප්‍රාථමික ක්‍රමය ක්‍රම තුනෙන් අඩුම විශේෂිත ක්‍රමයයි.ප්‍රයිමර් කෙටි, අර්ධ දිග cDNA නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා පිටපත පුරා බහුවිධ අඩවිවල ඇනෙල් කර ඇත.මෙම ක්‍රමය බොහෝ විට ද්විතියික ව්‍යුහාත්මක ප්‍රදේශ සහිත RNA සැකිලි වලින් 5′ පර්යන්ත අනුක්‍රම සහ cDNA ලබා ගැනීමට හෝ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමට නොහැකි ටර්මිනේටින් අඩවි සමඟ භාවිතා වේ.දිගම cDNA ලබා ගැනීම සඳහා, එක් එක් RNA සාම්පලයේ ප්‍රයිමර් සහ RNA අනුපාතය ආනුභවිකව තීරණය කළ යුතුය.සසම්භාවී ප්‍රාථමිකයේ ආරම්භක සාන්ද්‍රණය 20μl ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියකට 50 සිට 250ng දක්වා පරාසයක පවතී.සසම්භාවී ප්‍රාථමික භාවිතයෙන් සම්පූර්ණ RNA වලින් සංස්ලේෂණය කරන ලද cDNA ප්‍රධාන වශයෙන් ribosomal RNA වන නිසා, poly(A)+RNA සාමාන්‍යයෙන් අච්චුව ලෙස තෝරා ගැනේ.

Oligo(dT) ආරම්භය සසම්භාවී ප්‍රයිමර් වලට වඩා විශේෂිත වේ.එය බොහෝ යුකැරියෝටික් සෛලවල mRNA හි 3′ අන්තයේ ඇති පොලි(A) වලිගය සමඟ දෙමුහුන් වේ.පොලි(A)+RNA දළ වශයෙන් මුළු RNA වලින් 1% සිට 2% දක්වා වන නිසා, cDNA හි ප්‍රමාණය සහ සංකීර්ණත්වය අහඹු ප්‍රයිමර් භාවිතා කළාට වඩා බෙහෙවින් අඩුය.එහි ඉහළ විශේෂත්වය නිසා, oligo(dT) සාමාන්‍යයෙන් RNA සඳහා ප්‍රාථමික අනුපාතය සහ poly(A)+ තේරීම සඳහා ප්‍රශස්තකරණය අවශ්‍ය නොවේ.20μl ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියකට 0.5μg ඔලිගෝ (dT) භාවිතා කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.oligo(dT)12-18 බොහෝ RT-PCR සඳහා සුදුසු වේ.ThermoScript RT-PCR පද්ධතිය එහි හොඳ තාප ස්ථායීතාවය නිසා oligo(dT)20 සපයන අතර ඉහළ රඳවා ගැනීමේ උෂ්ණත්වයන් සඳහා සුදුසු වේ.

ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර් (GSP) යනු ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පියවර සඳහා හොඳම විශේෂිත ප්‍රයිමර් වේ.ජීඑස්පී යනු සසම්භාවී ප්‍රයිමර් හෝ ඔලිගෝ(ඩීටී) වැනි සියලුම ආර්එන්ඒ විනිශ්‍ය කිරීමට වඩා ආර්එන්ඒ ගමනාන්ත අනුපිළිවෙල සමඟ විශේෂයෙන් දෙමුහුන් කළ හැකි ප්‍රතිදේහජනක ඔලිගොනියුක්ලියෝසයිඩ් ය.PCR ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීම සඳහා භාවිතා කරන රීති ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාව GSP නිර්මාණය සඳහාද අදාළ වේ.GSP යනු mRNA3′ අවසානයේ ඇනීල් කරන ලද වර්ධක ප්‍රාථමිකයේ අනුපිළිවෙලම විය හැකිය, නැතහොත් GSP ප්‍රතිලෝම වර්ධක ප්‍රාථමිකය සමඟ පහළට ඇනෙනල් කිරීමට සැලසුම් කළ හැක.සමහර විස්තාරණය කරන ලද වස්තූන් සඳහා, සාර්ථක RT-PCR සඳහා ප්‍රතිදේහ ප්‍රාථමික එකකට වඩා සැලසුම් කිරීම අවශ්‍ය වේ, මන්ද ඉලක්ක RNA හි ද්විතියික ව්‍යුහය ප්‍රාථමිකය බන්ධනය වීම වැළැක්විය හැකිය.20μl හි පළමු දාම සංශ්ලේෂණ ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියේ 1pmol antisense GSP භාවිතා කිරීමට යෝජනා කෙරේ.

2. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ තාප සංරක්ෂණ උෂ්ණත්වය වැඩි කරන්න

GSP නිශ්චිතතාවයෙන් පූර්ණ ප්‍රයෝජන ගැනීම සඳහා, ඉහළ තාප ස්ථායීතාවයක් සහිත ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් භාවිතා කළ යුතුය.තාප ස්ථායී ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් ප්‍රතික්‍රියාවේ තද බව වැඩි කිරීම සඳහා ඉහළ උෂ්ණත්වවලදී පරිවරණය කළ හැක.උදාහරණයක් ලෙස, GSP එකක් 55°C දී ඇනීල් කර ඇත්නම්, AMV හෝ M-MLV භාවිතයෙන් අඩු දෘඩතාවයකින් 37°C දී ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සිදු කරන්නේ නම් GSP හි විශේෂත්වය සම්පූර්ණයෙන් භාවිතා නොවේ.කෙසේ වෙතත්, SuperScripⅡ සහ ThermoScript හට 50℃ හෝ ඊට වැඩි අගයකදී ප්‍රතික්‍රියා කළ හැකි අතර එමඟින් අඩු උෂ්ණත්වවලදී නිපදවන නිශ්චිත නොවන නිෂ්පාදන ඉවත් කරයි.උපරිම නිශ්චිතභාවය සඳහා, RNA/ ප්‍රාථමික මිශ්‍රණය 65℃ denaturation උෂ්ණත්වයේ සිට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ රඳවා ගැනීමේ උෂ්ණත්වයට පෙර රත් කළ 2 x ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයක් (cDNA සංස්ලේෂණයේ තාප ආරම්භය) එකතු කිරීම සමඟ සෘජුවම මාරු කළ හැක.මෙය අඩු උෂ්ණත්වවලදී අණු අතර මූලික යුගලනය වැලැක්වීමට උපකාරී වේ.PCR උපකරණයක් භාවිතා කිරීම RT-PCR සඳහා අවශ්‍ය බොහෝ උෂ්ණත්ව සංක්‍රාන්ති සරල කරයි.

3. ජානමය DNA දූෂණය අඩු කිරීම:

RT-PCR සමඟ ඇති විය හැකි එක් දුෂ්කරතාවයක් වන්නේ RNA ජානමය DNA දූෂණය කිරීමයි.ට්‍රයිසෝල් ප්‍රතික්‍රියාකාරක වැනි වඩා හොඳ ආර්එන්ඒ වෙන් කිරීමේ ක්‍රම භාවිතා කිරීම, ආර්එන්ඒ සූදානම තුළ ප්‍රවේණික ඩීඑන්ඒ දූෂණය අඩු කරයි.ප්‍රවේණික DNA වලින් නිපදවන නිෂ්පාදන වළක්වා ගැනීම සඳහා, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමට පෙර දූෂිත DNA ඉවත් කිරීමට RNA විස්තාරණ ශ්‍රේණියේ DnasⅠ සමඟ ප්‍රතිකාර කළ හැක.DNaseⅠ ජීර්ණය අවසන් කිරීම සඳහා සාම්පල 2.0mM EDTA හි 65℃ හි විනාඩි 10 ක් තබා ඇත.ඉහළ උෂ්ණත්වවලදී සිදුවන මැග්නීසියම් අයන මත යැපෙන RNA ජල විච්ඡේදනය වැළැක්වීමට EDTA මැග්නීසියම් අයන චෙලේට් කරයි.

ප්‍රවේණික DNA විස්තාරණ නිෂ්පාදනයෙන් විස්තාරණය කරන ලද cDNA වෙන් කිරීම සඳහා, වෙන් කරන ලද exon සමඟ වෙන වෙනම ඇනෙන ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කළ හැකිය.cDNA වලින් ලබාගත් PCR නිෂ්පාදන දූෂිත ජානමය DNA වලින් ලබාගත් ඒවාට වඩා කෙටි වේ.ලබා දී ඇති කැබැල්ලක් ප්‍රවේණික DNA ද cDNA ද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමකින් තොරව පාලිත පරීක්ෂණයක් ද එක් එක් RNA අච්චුව මත සිදු කරනු ලැබේ.ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම නොමැති විට ලබාගත් PCR නිෂ්පාදන ජෙනෝමයෙන් ලබා ගනී.

අදාළ නිෂ්පාදනය

RT-PCR පහසුයි^ᵀᴹමම (එක් පියවරක්)

-එක්-පියවර කට්ටලය ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ PCR එකම නළයක සිදු කිරීමට හැකියාව ලබා දෙයි.එයට අවශ්‍ය වන්නේ අච්චු RNA, නිශ්චිත PCR ප්‍රයිමර් සහ RNase-Free ddH එකතු කිරීම පමණි₂O.

RNA හි තත්‍ය කාලීන ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය ඉක්මනින් හා නිවැරදිව සිදු කළ හැක.

- කට්ටලය ප්‍රතික්‍රියාවේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සහ නිශ්චිතභාවය ඵලදායී ලෙස වැඩිදියුණු කිරීම සඳහා අද්විතීය ප්‍රතික්‍රියා පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් සහ Foregene HotStar Taq DNA පොලිමරේස් අද්විතීය ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියක් සමඟ ඒකාබද්ධ කරයි.

ප්‍රශස්ත ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය ප්‍රතික්‍රියාවට ඉහළ හඳුනාගැනීමේ සංවේදීතාවයක්, ශක්තිමත් තාප ස්ථායීතාවයක් සහ වඩා හොඳ ඉවසීමක් ඇති කරයි.

RT Easy II(GDNase සමඟ) Master Premix සඳහා පළමු පෙළ CDNA සංශ්ලේෂණය සඳහා GDNase සමඟ තත්‍ය කාලීන PCR

- විනාඩි 2 ක් ඇතුළත අච්චුවේ ඇති gDNA ඉවත් කළ හැකි gDNA ඉවත් කිරීමට කාර්යක්ෂම හැකියාව.

-කාර්යක්ෂම ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පද්ධතිය, පළමු කෙඳි cDNA සංශ්ලේෂණය සම්පූර්ණ කිරීමට ගත වන්නේ මිනිත්තු 15ක් පමණි.

-සංකීර්ණ සැකිලි: ඉහළ GC අන්තර්ගතය සහ සංකීර්ණ ද්විතියික ව්‍යුහය සහිත සැකිලි ද ඉහළ කාර්යක්ෂමතාවයකින් ආපසු හැරවිය හැක.

-ඉහළ සංවේදී ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පද්ධතිය, pg මට්ටමේ සැකිලි ද උසස් තත්ත්වයේ cDNA ලබා ගත හැක.

-ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පද්ධතියට ඉහළ තාප ස්ථායීතාවයක් ඇත, ප්‍රශස්ත ප්‍රතික්‍රියා උෂ්ණත්වය 42℃ වන අතර එය තවමත් 50℃ හි හොඳ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්ය සාධනයක් ඇත.