1. මූලික දැනුම (ඔබට පර්යේෂණාත්මක කොටස බැලීමට අවශ්ය නම්, කරුණාකර දෙවන කොටස වෙත කෙලින්ම මාරු කරන්න)
සාම්ප්‍රදායික PCR හි ව්‍යුත්පන්න ප්‍රතික්‍රියාවක් ලෙස, Real time PCR ප්‍රධාන වශයෙන් ප්රතිදීප්ත සංඥාව වෙනස් කිරීම හරහා PCR වර්ධක ප්‍රතික්‍රියාවේ එක් එක් චක්‍රය තුළ වර්ධක නිෂ්පාදන ප්‍රමාණයේ වෙනස්වීම තත්‍ය කාලීනව නිරීක්ෂණය කරයි, සහ ct අගය සහ සම්මත වක්‍රය අතර සම්බන්ධතාවය හරහා ආරම්භක අච්චුව ප්‍රමාණාත්මකව විශ්ලේෂණය කරයි.
RT-PCR හි නිශ්චිත දත්ත වේමූලික රේඛාව, fluorescence thresholdසහCt අගය.
| මූලික රේඛාව: | 3 වන-15 වන චක්රයේ ප්රතිදීප්ත අගය යනු පාදක රේඛාව (මූලික) වේ, එය වරින් වර මැනීමේ දෝෂය නිසා ඇතිවේ. |
| එළිපත්ත (ඉදිරිපස): | වර්ධක වක්‍රයේ ඝාතීය වර්ධන කලාපයේ සුදුසු ස්ථානයක පිහිටුවා ඇති ප්රතිදීප්ත හඳුනාගැනීමේ සීමාව වෙත යොමු කරයි, සාමාන්යයෙන් මූලික රේඛාවේ සම්මත අපගමනය මෙන් 10 ගුණයකි. |
| CT අගය: | එය එක් එක් ප්රතික්රියා නලයේ ප්රතිදීප්ත අගය එළිපත්තට ළඟා වන විට PCR චක්‍ර ගණන වේ. Ct අගය ආරම්භක අච්චුවේ ප්‍රමාණයට ප්‍රතිලෝමව සමානුපාතික වේ. |
RT-PCR සඳහා පොදු ලේබල් කිරීමේ ක්‍රම:
| ක්රමය | වාසිය | අඩුපාඩුවක් | අයදුම් විෂය පථය |
| SYBR හරිතⅠ | පුළුල් අදාළත්වය, සංවේදී, ලාභ සහ පහසු | ප්‍රයිමර් අවශ්‍යතා ඉහළයි, විශේෂිත නොවන බෑන්ඩ් වලට ගොදුරු වේ | විවිධ ඉලක්කගත ජානවල ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය, ජාන ප්‍රකාශනය පිළිබඳ පර්යේෂණ සහ සංක්‍රාන්ති ප්‍රතිසංයෝජක සතුන් සහ ශාක පිළිබඳ පර්යේෂණ සඳහා එය සුදුසු වේ. |
| TaqMan | හොඳ නිශ්චිතභාවය සහ ඉහළ පුනරාවර්තන හැකියාව | මිල ඉහළ වන අතර නිශ්චිත ඉලක්ක සඳහා පමණක් සුදුසු වේ. | ව්යාධිජනක හඳුනාගැනීම, ඖෂධ ප්රතිරෝධක ජාන පර්යේෂණ, ඖෂධ කාර්යක්ෂමතාව තක්සේරු කිරීම, ජානමය රෝග නිර්ණය කිරීම. |
| අණුක ආලෝකය | ඉහළ නිශ්චිතතාව, ප්රතිදීප්තතාව, අඩු පසුබිම | මිල ඉහළයි, එය විශේෂිත අරමුණක් සඳහා පමණක් සුදුසු වේ, නිර්මාණය දුෂ්කර වන අතර මිල ඉහළ ය. | විශේෂිත ජාන විශ්ලේෂණය, SNP විශ්ලේෂණය |
2. පර්යේෂණාත්මක පියවර
2.1 පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායම්කරණය ගැන- සමූහයේ ළිං කිහිපයක් තිබිය යුතු අතර ජීව විද්‍යාත්මක පුනරාවර්තන තිබිය යුතුය.
| ① | හිස් පාලනය | පරීක්ෂණ වලදී සෛල වර්ධන තත්ත්වය හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කරයි |
| ② | සෘණ පාලන siRNA (විශේෂිත නොවන siRNA අනුපිළිවෙල) | RNAi ක්‍රියාවෙහි විශේෂත්වය නිරූපණය කරන්න.siRNA 200nM සාන්ද්‍රණයකදී විශේෂිත නොවන ආතති ප්‍රතිචාරයක් ඇති කළ හැක. |
| ③ | සංක්‍රමණ ප්රතික්රියාකාරක පාලනය | සෛල වෙත මාරු කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයේ විෂ වීම හෝ ඉලක්කගත ජානයේ ප්‍රකාශනය කෙරෙහි ඇති බලපෑම බැහැර කරන්න |
| ④ | ඉලක්ක ජානයට එරෙහිව siRNA | ඉලක්කගත ජානයේ ප්‍රකාශනය තට්ටු කරන්න |
| ⑤ (විකල්ප) | ධනාත්මක siRNA | පරීක්ෂණ පද්ධතිය සහ මෙහෙයුම් ගැටළු නිරාකරණය කිරීමට භාවිතා කරයි |
| ⑥ (විකල්ප) | ප්රතිදීප්ත පාලන siRNA | සෛල මාරු කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව අන්වීක්ෂයකින් නිරීක්ෂණය කළ හැකිය |
2.2 ප්‍රාථමික නිර්මාණයේ මූලධර්ම
| විස්තාරණය කරන ලද කොටස් ප්රමාණය | 100-150bp දී වඩාත් සුදුසුය |
| ප්‍රයිමර් දිග | 18-25bp |
| GC අන්තර්ගතය | 30%-70%, වඩාත් සුදුසු 45%-55% |
| Tm අගය | 58-60℃ |
| අනුපිළිවෙල | T/C අඛණ්ඩව වළකින්න;A/G අඛණ්ඩ |
| 3 අවසන් අනුපිළිවෙල | GC පොහොසත් හෝ AT පොහොසත් වළකින්න;පර්යන්ත පදනම වඩාත් සුදුසු G හෝ C වේ;ටී වළක්වා ගැනීම වඩාත් සුදුසුය |
| අනුපූරකත්වය | ප්‍රයිමරය තුළ හෝ ප්‍රයිමර් දෙකක් අතර පාද 3කට වඩා වැඩි අනුපූරක අනුපිළිවෙලින් වළකින්න |
| විශේෂත්වය | ප්‍රාථමිකයේ විශේෂත්වය තහවුරු කිරීමට පිපිරුම් සෙවීම භාවිතා කරන්න |
①SiRNA විශේෂ-විශේෂිත වන අතර විවිධ විශේෂවල අනුපිළිවෙල වෙනස් වේ.
②SiRNA ශීත කළ වියළන ලද කුඩු වල ඇසුරුම් කර ඇති අතර, කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සති 2-4 ක් ස්ථායීව ගබඩා කළ හැක.
2.3 කල්තියා සූදානම් කළ යුතු මෙවලම් හෝ ප්රතික්රියාකාරක
| ප්‍රයිමර් (අභ්‍යන්තර යොමුව) | ඉදිරි සහ ප්‍රතිලෝම දෙක ඇතුළුව |
| ප්‍රයිමර් (ඉලක්ක ජානය) | ඉදිරි සහ ප්‍රතිලෝම දෙක ඇතුළුව |
| ඉලක්ක Si RNA (තීරු 3) | සාමාන්යයෙන්, සමාගම තීරු 3 ක් සංස්ලේෂණය කරයි, ඉන්පසු RT-PCR මඟින් තුනෙන් එකක් තෝරා ගනු ඇත. |
| මාරු කිරීමේ කට්ටලය | Lipo2000 ආදිය. |
| RNA වේගවත් නිස්සාරණ කට්ටලය | මාරු කිරීමෙන් පසු RNA නිස්සාරණය සඳහා |
| වේගවත් ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කට්ටලය | cDNA සංශ්ලේෂණය සඳහා |
| PCR විස්තාරණ කට්ටලය | 2×සුපිරි SYBR කොළ qPCR මාස්ටර් මික්ස් |
2.4 නිශ්චිත පර්යේෂණාත්මක පියවරයන්හිදී අවධානය යොමු කළ යුතු ගැටළු සම්බන්ධයෙන්:
①siRNA මාරු කිරීමේ ක්රියාවලිය
1. ආලේප කිරීම සඳහා, ඔබට ළිං 24 තහඩු, 12-ළිං තහඩු හෝ 6-ළිං තහඩු තෝරාගත හැක (ළිං 24 තහඩුවක සෑම ළිඳකම යෝජිත සාමාන්‍ය RNA සාන්ද්‍රණය 100-300 ng/uL පමණ වේ), සහ සෛලවල ප්‍රශස්ත සංක්‍රමණ ඝනත්වය 60 %-80% හෝ ඊට වැඩි වේ.
2. මාරු කිරීමේ පියවර සහ නිශ්චිත අවශ්‍යතා දැඩි ලෙස උපදෙස් වලට අනුකූල වේ.
3. මාරු කිරීමෙන් පසු, mRNA හඳුනාගැනීම සඳහා (RT-PCR) හෝ පැය 48-96 තුළ (WB) ප්‍රෝටීන් හඳුනාගැනීම සඳහා පැය 24-72 තුළ සාම්පල එකතු කළ හැක.
② RNA නිස්සාරණ ක්රියාවලිය
1. බාහිර එන්සයිම මගින් දූෂණය වීම වැළැක්වීම.එයට ප්‍රධාන වශයෙන් වෙස් මුහුණු සහ අත්වැසුම් පැළඳීම ඇතුළත් වේ;විෂබීජහරණය කළ පයිප්ප ඉඟි සහ EP නල භාවිතා කිරීම;අත්හදා බැලීමේදී භාවිතා කරන ජලය RNase-නිදහස් විය යුතුය.
2. ඉක්මන් නිස්සාරණ කට්ටලයේ යෝජනා කර ඇති පරිදි දෙවරක් කිරීමට නිර්දේශ කරනු ලැබේ, එය සැබවින්ම සංශුද්ධතාවය සහ අස්වැන්න වැඩි දියුණු කරනු ඇත.
3. අපද්රව්ය ද්රව RNA තීරුව ස්පර්ශ නොකළ යුතුය.
③ RNA ප්‍රමාණකරණය
RNA නිස්සාරණය කිරීමෙන් පසුව, එය නැනෝඩ්‍රොප් සමඟ සෘජුවම ප්‍රමාණ කළ හැකි අතර අවම කියවීම 10ng/ul තරම් අඩු විය හැක.
④ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්රියාවලිය
1. RT-qPCR හි ඉහළ සංවේදීතාවය හේතුවෙන්, එක් එක් නියැදිය සඳහා අවම වශයෙන් සමාන්තර ළිං 3ක් සෑදිය යුතු අතර, පසුව එන Ct ඉතා වෙනස් වීම හෝ සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සඳහා SD විශාල වීම වැළැක්වීම සඳහා.
2. නැවත නැවතත් කැටි කිරීම සහ දියවීම මාස්ටර් මිශ්ර නොකරන්න.
3. සෑම නලයක්ම / සිදුරක්ම නව ඉඟියකින් ප්‍රතිස්ථාපනය කළ යුතුය!සාම්පල එකතු කිරීම සඳහා එකම පයිපෙට් ඉඟිය අඛණ්ඩව භාවිතා නොකරන්න!
4. නියැදිය එකතු කිරීමෙන් පසු 96-ළිං තහඩුවට සවි කර ඇති චිත්රපටය තහඩුවකින් සුමට කිරීම අවශ්ය වේ.යන්ත්‍රය මත තැබීමට පෙර කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීම වඩාත් සුදුසුය, එවිට නල බිත්තියේ ඇති ද්‍රවය පහළට ගලා ගොස් වායු බුබුලු ඉවත් කළ හැකිය.
⑤පොදු වක්‍ර විශ්ලේෂණය
| ලඝුගණක වර්ධනයේ කාල පරිච්ඡේදයක් නොමැත | සැකිල්ලේ ඉහළ සාන්ද්‍රණයක් විය හැක |
| CT අගයක් නැත | ප්රතිදීප්ත සංඥා හඳුනාගැනීම සඳහා වැරදි පියවර; ප්‍රාථමික හෝ පිරික්සුම් පිරිහීම - එහි අඛණ්ඩතාව PAGE විද්යුත් විච්ඡේදනය මගින් හඳුනාගත හැකිය; සැකිල්ල ප්රමාණවත් නොවේ; සැකිලි පිරිහීම - අපිරිසිදු ද්රව්ය හඳුන්වාදීම වැළැක්වීම සහ නියැදි සකස් කිරීමේදී නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම; |
| Ct>38 | අඩු විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව;PCR නිෂ්පාදනය දිග වැඩියි;විවිධ ප්රතික්රියා සංරචක දිරාපත් වේ |
| රේඛීය විස්තාරණ වක්‍රය | නැවත නැවත කැටි- දියවන චක්‍ර හෝ ආලෝකයට දිගු කලක් නිරාවරණය වීමෙන් පරීක්ෂණ අර්ධ වශයෙන් ක්ෂය විය හැක. |
| අනුපිටපත් සිදුරු වල වෙනස විශේෂයෙන් විශාල වේ | ප්රතික්රියා ද්‍රාවණය සම්පූර්ණයෙන්ම උණු වී හෝ ප්රතික්රියා ද්‍රාවණය මිශ්ර නොවේ;PCR උපකරණයේ තාප ස්නානය ප්රතිදීප්ත ද්රව්ය මගින් දූෂිත වේ |
2.5 දත්ත විශ්ලේෂණය ගැන
qPCR හි දත්ත විශ්ලේෂණය සාපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණය සහ නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණය ලෙස බෙදිය හැකිය.උදාහරණයක් ලෙස, පාලන කණ්ඩායමේ සෛල හා සසඳන විට ප්‍රතිකාර කණ්ඩායමේ සෛල,
X ජානයේ mRNA කොපමණ වාරයක් වෙනස් වේද, මෙය සාපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණයකි;නිශ්චිත සෛල ගණනක, X ජානයේ mRNA
පිටපත් කීයක් තිබේද, මෙය නිරපේක්ෂ ප්රමාණනයකි.සාමාන්යයෙන් අපි රසායනාගාරයේ වැඩිපුරම භාවිතා කරන්නේ සාපේක්ෂ ප්‍රමාණාත්මක ක්‍රමයයි.සාමාන්යයෙන්,2-ΔΔct ක්රමයඅත්හදා බැලීම් වලදී වැඩිපුරම භාවිතා වේ, එබැවින් මෙම ක්රමය පමණක් මෙහි විස්තරාත්මකව හඳුන්වා දෙනු ඇත.
2-ΔΔct ක්රමය: ලබාගත් ප්‍රතිඵලය වන්නේ පාලන කාණ්ඩයේ ඉලක්කගත ජානයට සාපේක්ෂව පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායමේ ඉලක්ක ජානයේ ප්‍රකාශනයේ වෙනසයි.ඉලක්කගත ජානයේ සහ අභ්‍යන්තර විමර්ශන ජාන දෙකෙහිම විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 100%කට ආසන්න වීම අවශ්ය වන අතර සාපේක්ෂ අපගමනය 5% නොඉක්මවිය යුතුය.
ගණනය කිරීමේ ක්රමය පහත පරිදි වේ:
Δct පාලන කණ්ඩායම = පාලන කණ්ඩායමේ ඉලක්ක ජානයේ ct අගය - පාලන කණ්ඩායමේ අභ්‍යන්තර විමර්ශන ජානයේ ct අගය
Δct පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායම = පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායමේ ඉලක්ක ජානයේ ct අගය - පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායමේ අභ්‍යන්තර විමර්ශන ජානයේ ct අගය
ΔΔct=Δct පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායම-Δct පාලන කණ්ඩායම
අවසාන වශයෙන්, ප්‍රකාශන මට්ටමේ වෙනසෙහි ගුණාකාර ගණනය කරන්න:
Fold=2-ΔΔct වෙනස් කරන්න (එක්සෙල් ශ්‍රිතයට අනුරූප වන්නේ POWER)
ආශ්රිත නිෂ්පාදන:
පසු කාලය: මැයි-20-2023
