- PCR යනු DNA සැකිල්ල කුඩා ප්‍රමාණයකින් DNA විස්තාරණය කිරීමට භාවිතා කරන ක්‍රමයකි.RT-PCR RNA ප්‍රභවයකින් DNA අච්චුවක් නිපදවීමට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම භාවිතා කරයි.
- PCR සහ RT-PCR සාමාන්යයෙන් අන්ත ලක්ෂ්‍ය ප්‍රතික්‍රියා වන අතර, qPCR සහ RT-qPCR PCR ප්‍රතික්‍රියාව අතරතුර නිෂ්පාදන සංශ්ලේෂණ අනුපාතයේ චාලක විද්‍යාව භාවිතා කරන්නේ පවතින අච්චු ප්‍රමාණය ගණනය කිරීම සඳහා ය.
- ඩිජිටල් PCR වැනි නව ක්‍රම මගින් මූලික DNA සැකිල්ලේ නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණය ලබා දෙන අතර, isothermal PCR වැනි ක්‍රම විශ්වාසනීය ප්‍රතිඵල ලබා දීම සඳහා මිල අධික උපකරණවල අවශ්‍යතාවය අඩු කරයි.
පොලිමරේස් දාම ප්‍රතික්‍රියාව (PCR) යනු DNA සහ RNA අනුක්‍රම විස්තාරණය කිරීමට සහ හඳුනා ගැනීමට සාපේක්ෂව සරල සහ බහුලව භාවිතා වන අණුක ජීව විද්‍යා තාක්‍ෂණයකි.බොහෝ විට දින ගත විය හැකි DNA ක්ලෝනකරණය සහ විස්තාරණය කිරීමේ සම්ප්‍රදායික ක්‍රම හා සසඳන විට, PCR සඳහා අවශ්‍ය වන්නේ පැය කිහිපයක් පමණි.PCR ඉතා සංවේදී වන අතර නිශ්චිත අනුපිළිවෙල හඳුනා ගැනීම සහ විස්තාරණය කිරීම සඳහා අවම අච්චුවක් අවශ්‍ය වේ.මූලික PCR ක්‍රම සරල DNA සහ RNA හඳුනාගැනීමේ සිට තවදුරටත් දියුණු වී ඇත.පහත, අපි ඔබේ පර්යේෂණ අවශ්‍යතා සඳහා Enzo Life Sciences හි විවිධ PCR ක්‍රම සහ ප්‍රතික්‍රියාකාරක පිළිබඳ දළ විශ්ලේෂණයක් සපයා ඇත.විද්‍යාඥයින්ට ඔවුන්ගේ මීළඟ පර්යේෂණ ව්‍යාපෘතිය සඳහා PCR ප්‍රතික්‍රියාකාරක වෙත ඉක්මනින් ප්‍රවේශ වීමට උපකාර කිරීම අපගේ අරමුණයි!
PCR
සම්මත PCR සඳහා, ඔබට අවශ්‍ය වන්නේ DNA පොලිමරේස්, මැග්නීසියම්, නියුක්ලියෝටයිඩ, ප්‍රයිමර්, විස්තාරණය කළ යුතු DNA අච්චුව සහ තාප චක්‍රයකි.PCR යාන්ත්‍රණය එහි පරමාර්ථය තරම්ම සරල ය: 1) ද්විත්ව නූල් DNA (dsDNA) තාපය ඉවත් කර ඇත, 2) ප්‍රයිමර් තනි DNA කෙඳිවලට සමපාත වේ, සහ 3) DNA පොලිමරේස් මගින් ප්‍රයිමර් දිගු කර ඇති අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස එහි පිටපත් දෙකක් ලැබේ. මුල් DNA නූල්.උෂ්ණත්ව හා වේලාවන් මාලාවක් හරහා denaturation, annealing සහ දිගු කිරීමේ ක්රියාවලිය විස්තාරණ එක් චක්රයක් ලෙස හැඳින්වේ (රූපය 1).
|
|
| රූපය 1.PCR මගින් විස්තාරණය කිරීමේ චක්‍රයක ක්‍රමානුකූල නිරූපණය. |
චක්‍රයේ සෑම පියවරක්ම භාවිතා කරන අච්චුව සහ ප්‍රාථමික කට්ටලය සඳහා ප්‍රශස්ත කළ යුතුය.මෙම චක්රය ආසන්න වශයෙන් 20-40 වාරයක් පුනරාවර්තනය වන අතර, විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදිතය සාමාන්යයෙන් ඇගරෝස් ජෙල් මගින් විශ්ලේෂණය කළ හැක (රූපය 2).
| |
| රූපය 2.PCR මගින් DNA සැකිල්ලක් විස්තාරණය කිරීම සහ agarose gel electrophoresis මගින් විශ්ලේෂණය. |
PCR යනු ඉතා සංවේදී ක්‍රමයක් වන අතර තනි ප්‍රතික්‍රියා සඳහා ඉතා කුඩා පරිමාවක් අවශ්‍ය වන බැවින්, ප්‍රතික්‍රියා කිහිපයක් සඳහා ප්‍රධාන මිශ්‍රණයක් සකස් කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.ප්‍රධාන මිශ්‍රණය හොඳින් මිශ්‍ර කර ප්‍රතික්‍රියා ගණනින් බෙදිය යුතුය, සෑම ප්‍රතික්‍රියාවකම එන්සයිම, dNTPs සහ ප්‍රයිමර් ප්‍රමාණයම අඩංගු බව සහතික කරයි.Enzo Life Sciences වැනි බොහෝ සැපයුම්කරුවන් දැනටමත් ප්‍රයිමර් සහ DNA අච්චුව හැර අනෙකුත් සියල්ල අඩංගු PCR මිශ්‍රණ පිරිනමයි.
Guanine/Cytosine-rich (GC-rich) කලාප සම්මත PCR ශිල්පීය ක්‍රමවල අභියෝගයක් නියෝජනය කරයි.GC පොහොසත් අනුපිළිවෙලවල් අඩු GC අන්තර්ගතය සහිත අනුපිළිවෙලට වඩා ස්ථායී වේ.තවද, GC-පොහොසත් අනුපිළිවෙලවල් හිසකෙස් ලූප වැනි ද්විතියික ව්‍යුහයන් සෑදීමට නැඹුරු වේ.එහි ප්‍රතිඵලයක් වශයෙන්, GC-පොහොසත් ද්විත්ව කෙඳි denaturation අදියරේදී සම්පූර්ණයෙන්ම වෙන් කිරීමට අපහසු වේ.එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස, DNA පොලිමරේස් හට බාධාවකින් තොරව නව කෙඳි සංස්ලේෂණය කළ නොහැක.ඉහළ denaturation උෂ්ණත්වයක් මෙය වැඩිදියුණු කළ හැකි අතර, ඉහළ annealing උෂ්ණත්වය සහ කෙටි annealing කාලය වෙත ගැලපීම් GC-rich primers නිශ්චිත නොවන බන්ධනය වැළැක්විය හැකිය.අතිරේක ප්‍රතික්‍රියාකාරකවලට GC පොහොසත් අනුක්‍රමවල විස්තාරණය වැඩි දියුණු කළ හැක.DMSO, glycerol සහ betaine GC අන්තර්ක්‍රියා නිසා ඇතිවන ද්විතියික ව්‍යුහයන් කඩාකප්පල් කිරීමට සහ එමඟින් ද්විත්ව කෙඳි වෙන් කිරීමට පහසුකම් සපයයි.
උණුසුම් ආරම්භය PCR
නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය PCR අතරතුර ඇතිවිය හැකි ගැටළුවකි.PCR සඳහා භාවිතා කරන බොහෝ DNA පොලිමරේස් 68°C සිට 72°C පමණ උෂ්ණත්වවලදී හොඳින් ක්රියා කරයි.එන්සයිම, කෙසේ වෙතත්, අඩු මට්ටමකට වුවද, අඩු උෂ්ණත්වවලදී ද ක්රියාකාරී විය හැක.උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වයට වඩා බෙහෙවින් අඩු උෂ්ණත්වවලදී, ප්‍රයිමර්වලට නිශ්චිත නොවන ලෙස බැඳිය හැකි අතර, ප්‍රතික්‍රියාව අයිස් මත පිහිටුවා තිබුණද, විශේෂිත නොවන විස්තාරණයකට මඟ පෑදිය හැක.නිශ්චිත උෂ්ණත්වයකට ළඟා වූ විට පමණක් DNA පොලිමරේස් වලින් විඝටනය වන පොලිමරේස් නිෂේධක භාවිතා කිරීමෙන් මෙය වළක්වා ගත හැකිය, එබැවින් උණුසුම් ආරම්භක PCR යන යෙදුම.නිෂේධකය යනු පොලිමරේස් බන්ධනය කරන ප්‍රතිදේහයක් විය හැකි අතර ආරම්භක අවප්‍රමාණයේ උෂ්ණත්වයේ දී (සාමාන්යයෙන් 95°C) denatures වේ.
ඉහළ විශ්වාසනීය පොලිමරේස්
DNA පොලිමරේස් මුල් සැකිලි අනුපිළිවෙලට තරමක් නිවැරදිව විස්තාරණය කරන අතර, නියුක්ලියෝටයිඩ ගැලපීමේදී වැරදි සිදු විය හැක.ක්ලෝන කිරීම වැනි යෙදුම්වල නොගැලපීම් ප්‍රතිඵලයක් ලෙස කප්පාදු කළ පිටපත්, සහ වැරදි ලෙස පරිවර්තන හෝ අක්‍රිය ප්‍රෝටීන පහළට ඇති විය හැක.මෙම නොගැලපීම් වලක්වා ගැනීම සඳහා, "සෝදුපත් කියවීමේ" ක්රියාකාරිත්වය සහිත පොලිමරේස් හඳුනාගෙන වැඩ ප්රවාහයට ඇතුළත් කර ඇත.පළමු සෝදුපත් කියවීමේ පොලිමරේස්, Pfu, 1991 දී Pyrococcus furiosus හි හඳුනා ගන්නා ලදී.මෙම Pfu එන්සයිමයට 3' සිට 5' දක්වා exonuclease ක්‍රියාකාරීත්වයක් ඇත.ඩීඑන්ඒ විස්තාරණය කරන විට, එක්සෝනියුක්ලීස් නූල්වල 3' අන්තයේ නොගැලපෙන නියුක්ලියෝටයිඩ ඉවත් කරයි.එවිට නිවැරදි නියුක්ලියෝටයිඩය ප්‍රතිස්ථාපනය වන අතර DNA සංස්ලේෂණය දිගටම සිදුවේ.වැරදි නියුක්ලියෝටයිඩ අනුපිළිවෙල හඳුනා ගැනීම එන්සයිම සමඟ නිවැරදි නියුක්ලියෝසයිඩ් ට්‍රයිපොස්පේට් සඳහා බන්ධන සම්බන්ධතාවය මත පදනම් වේ, එහිදී අකාර්යක්ෂම බන්ධනය සංශ්ලේෂණය මන්දගාමී වන අතර නිවැරදි ප්‍රතිස්ථාපනයට ඉඩ සලසයි.Pfu polymerase හි සෝදුපත් කියවීමේ ක්‍රියාකාරකම් Taq DNA පොලිමරේස් හා සසඳන විට අවසාන අනුපිළිවෙලෙහි අඩු දෝෂ ඇති කරයි.මෑත වසරවලදී, වෙනත් සෝදුපත් කියවීමේ එන්සයිම හඳුනාගෙන ඇති අතර, DNA විස්තාරණය කිරීමේදී දෝෂ අනුපාතය තවදුරටත් අඩු කිරීම සඳහා මුල් Pfu එන්සයිමයේ වෙනස් කිරීම් සිදු කර ඇත.
RT-PCR
ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ PCR, හෝ RT-PCR, අච්චුවක් ලෙස RNA භාවිතයට ඉඩ දෙයි.අතිරේක පියවරක් මඟින් RNA හඳුනා ගැනීමට සහ විස්තාරණය කිරීමට ඉඩ ලබා දේ.ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් භාවිතයෙන් RNA අනුපූරක DNA (cDNA) බවට ප්‍රතිලෝම පිටපත් කරනු ලැබේ.RT-PCR හි සාර්ථකත්වය සඳහා RNA අච්චුවේ ගුණාත්මකභාවය සහ සංශුද්ධතාවය අත්‍යවශ්‍ය වේ.RT-PCR හි පළමු පියවර වන්නේ DNA/RNA දෙමුහුන් සංශ්ලේෂණයයි.ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් හි RNase H ශ්‍රිතයක් ද ඇත, එය දෙමුහුන් වල RNA කොටස පිරිහීමට ලක් කරයි.ඉන්පසුව ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේසයේ DNA මත යැපෙන DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරකම් cDNA බවට පත් කිරීම මගින් තනි කෙඳි DNA අණුව සම්පූර්ණ වේ.පළමු කෙඳි ප්‍රතික්‍රියාවේ කාර්යක්ෂමතාවය විස්තාරණ ක්‍රියාවලියට බලපෑ හැකිය.මෙතැන් සිට, cDNA විස්තාරණය කිරීම සඳහා සම්මත PCR ක්රියා පටිපාටිය භාවිතා කරයි.RT-PCR මගින් RNA cDNA බවට ප්‍රතිවර්තනය කිරීමේ හැකියාව බොහෝ වාසි ඇති අතර එය මූලික වශයෙන් ජාන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය සඳහා යොදා ගනී.RNA තනි නූල් සහ ඉතා අස්ථායී වන අතර, එය සමඟ වැඩ කිරීම අභියෝගාත්මක කරයි.එය සාමාන්යයෙන් ජීව විද්‍යාත්මක නියැදියක RNA පිටපත් ප්‍රමාණනය කරන qPCR හි පළමු පියවර ලෙස ක්රියා කරයි.
qPCR සහ RT-qPCR
ප්‍රමාණාත්මක PCR (qPCR) බොහෝ යෙදුම් සඳහා න්‍යෂ්ටික අම්ල හඳුනා ගැනීමට, සංලක්ෂිත කිරීමට සහ ප්‍රමාණ කිරීමට භාවිතා කරයි.RT-qPCR හි, RNA පිටපත් බොහෝ විට ප්‍රමාණනය කරනු ලබන්නේ ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි ඒවා ප්‍රථමයෙන් cDNA වෙත ප්‍රතිවර්තනය කිරීමෙනි, පසුව qPCR පසුව සිදු කෙරේ.සම්මත PCR හි මෙන්, DNA පුනරාවර්තන පියවර තුනකින් විස්තාරණය කරනු ලැබේ: denaturation, annealing සහ දිගු කිරීම.කෙසේ වෙතත්, qPCR හි, ප්‍රතිදීප්ත ලේබල් කිරීම PCR ප්‍රගතියත් සමඟ දත්ත රැස් කිරීම සක්‍රීය කරයි.පවතින ක්‍රම සහ රසායන විද්‍යාව නිසා මෙම තාක්ෂණයට බොහෝ ප්‍රතිලාභ ඇත.
සායම් මත පදනම් වූ qPCR (සාමාන්යයෙන් කොළ පැහැති), ප්‍රතිදීප්ත ලේබල් කිරීම මගින් dsDNA බන්ධන සායම් භාවිතා කිරීමෙන් විස්තාරණය කරන ලද DNA අණු ප්‍රමාණ කිරීමට ඉඩ ලබා දේ.එක් එක් චක්රය තුළදී, ප්රතිදීප්තතාව මනිනු ලැබේ.ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව ප්‍රතිවර්තිත DNA ප්‍රමාණයට සමානුපාතිකව වැඩිවේ.එබැවින්, DNA "තථ්‍ය කාලීන" ප්‍රමාණාත්මක වේ (රූපය 3).ඩයි-පාදක qPCR හි අවාසි නම්, වරකට එක් ඉලක්කයක් පමණක් පරීක්ෂා කළ හැකි අතර සාම්පලයේ ඇති ඕනෑම ds-DNA සමඟ සායම් බැඳේ.
|
|
| රූපය 3.qPCR මගින් DNA අච්චුවක් විස්තාරණය කිරීම සහ තත්‍ය කාලීනව ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව මැනීම. |
ප්‍රොබ්-පාදක qPCR හි, එක් එක් නියැදිය තුළ බොහෝ ඉලක්ක එකවර අනාවරණය කර ගත හැක, නමුත් මේ සඳහා ප්‍රයිමර් වලට අමතරව භාවිතා කරන ඉලක්ක-විශේෂිත පරීක්ෂණයක් (ය) ප්‍රශස්තිකරණය සහ සැලසුම් කිරීම අවශ්‍ය වේ.ගවේෂණ සැලසුම් වර්ග කිහිපයක් තිබේ, නමුත් වඩාත් සුලභ වර්ගය වන්නේ ෆ්ලෝරෝෆෝර් සහ නිවාදැමීමක් ඇතුළත් වන ජල විච්ඡේදක පරීක්ෂණයකි.ප්‍රතිදීප්ත අනුනාද ශක්ති හුවමාරුව (FRET) පරීක්ෂණය නොවෙනස්ව පවතින අතරතුර නිවාදැමීම හරහා ෆ්ලෝරෝෆෝරය විමෝචනය වීම වළක්වයි.කෙසේ වෙතත්, PCR ප්‍රතික්‍රියාව අතරතුර, ප්‍රාථමික දිගුවේදී සහ එය බැඳී ඇති නිශ්චිත අනුක්‍රමය විස්තාරණය කිරීමේදී පරීක්ෂණය ජල විච්ඡේදනය වේ.පරීක්ෂණයෙහි බෙදීම නිවාදැමීමෙන් ෆ්ලෝරෝෆෝරය වෙන් කරන අතර ප්‍රතිදීප්තියේ විස්තාරණය මත යැපෙන වැඩි වීමක් ඇති කරයි (රූපය 4).මේ අනුව, පරීක්ෂණ පාදක qPCR ප්‍රතික්‍රියාවක ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව නියැදියේ ඇති පරීක්ෂණ ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි ප්‍රමාණයට සමානුපාතික වේ.ප්‍රොබ්-පාදක qPCR සායම් මත පදනම් වූ qPCR වලට වඩා නිශ්චිත බැවින්, එය බොහෝ විට qPCR මත පදනම් වූ රෝග විනිශ්චය සඳහා භාවිතා කරන තාක්ෂණය වේ.
| |
| රූපය 4.සායම් මත පදනම් වූ සහ පරීක්ෂණ පදනම් වූ qPCR අතර වෙනස්කම්. |
සමෝෂ්ණ විස්තාරණය
ඉහත සඳහන් කරන ලද PCR තාක්ෂණික ක්‍රමවලට නිරාකරණය, ඇනීම සහ විස්තාරණ පියවර සඳහා කුටියේ උෂ්ණත්වය නිවැරදිව ඉහළට සහ පහළට නැංවීමට මිල අධික තාප සයිකල් උපකරණ අවශ්‍ය වේ.එවැනි නිශ්චිත උපාංග අවශ්‍ය නොවන තාක්ෂණික ක්‍රම ගණනාවක් දියුණු කර ඇති අතර සරල ජල ස්නානයක හෝ උනන්දුවක් දක්වන සෛල තුළ පවා සිදු කළ හැකිය.මෙම ශිල්පීය ක්‍රම සාමූහිකව සමතාප විස්තාරණය ලෙස හඳුන්වන අතර ඝාතීය, රේඛීය හෝ කඳුරැල්ල විස්තාරණය මත පදනම්ව ක්රියා කරයි.
වඩාත් ප්‍රසිද්ධ සමෝෂ්ණ විස්තාරණ වර්ගය වන්නේ ලූප්-මැදිහත් වූ සම තාප විස්තාරණය හෝ LAMP ය.අච්චු DNA හෝ RNA විස්තාරණය කිරීමට LAMP 65⁰C හි ඝාතීය විස්තාරණය භාවිතා කරයි.LAMP සිදු කරන විට, නව DNA සංස්ලේෂණය කිරීම සඳහා ඉලක්කගත DNA වල ප්‍රදේශ වලට අනුපූරක ප්‍රයිමර් හතරක් හෝ හයක් DNA පොලිමරේස් සමඟ භාවිතා කරයි.මෙම ප්‍රාථමික දෙකෙහි අනුපූරක අනුපිළිවෙලවල් ඇති අතර එය අනෙකුත් ප්‍රයිමර් වල අනුපිළිවෙල හඳුනාගෙන ඒවා බන්ධනය කරයි, අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද DNA තුළ “ලූප්” ව්‍යුහයක් සෑදීමට ඉඩ සලසයි, එය පසුව වර්ධක වට වලදී ප්‍රයිමර් ඇනීල් කිරීමට උපකාරී වේ.ප්රතිදීප්තතාව, ඇගරෝස් ජෙල් විද්යුත් විච්ඡේදනය හෝ වර්ණමිතිය ඇතුළු බහුවිධ ක්‍රම මගින් LAMP දෘශ්‍යමාන කළ හැක.වර්ණමිතිය මගින් නිෂ්පාදනයේ පවතින හෝ නොපැවතීම දෘශ්‍යමාන කිරීමේ සහ හඳුනාගැනීමේ පහසුව සහ අවශ්‍ය මිල අධික උපකරණ නොමැතිකම සායනික රසායනාගාර පරීක්ෂණ පහසුවෙන් ලබා ගත නොහැකි හෝ සාම්පල ගබඩා කිරීම සහ ප්‍රවාහනය කළ නොහැකි ප්‍රදේශවල SARS-CoV-2 පරීක්ෂණ සඳහා LAMP සුදුසු විකල්පයක් බවට පත් කළේය. එය කළ නොහැකි විය, නැතහොත් මීට පෙර PCR තාප සයිකල් උපකරණ නොතිබූ රසායනාගාරවල.
පසු කාලය: අගෝස්තු-19-2023
