ප්රාථමික සැලසුම් පදනම (99% ගැටළු විසඳිය හැක)
1. ප්රාථමික දිග: පෙළ පොතට 15-30bp අවශ්ය වේ, සාමාන්‍යයෙන් 20bp පමණ වේ.නිශ්චිතභාවය සහතික කිරීම සඳහා සැබෑ තත්ත්වය 18-24bp වීම වඩා හොඳය, නමුත් වඩා හොඳ, දිගු ප්‍රාථමිකය ද විශේෂත්වය අඩු කරයි, සහ අස්වැන්න අඩු කරයි.
2. ප්රාථමික විස්තාරණ පරාසය: 200-500bp සුදුසු වන අතර, විශේෂිත තත්ව යටතේ ඛණ්ඩය 10kb දක්වා පුළුල් කළ හැක.
3. ප්‍රයිමර් පදනම: G+C හි අන්තර්ගතය 40-60% විය යුතුය, ඉතා කුඩා G+C වර්ධක ආචරණය හොඳ නැත, G+C වැඩි ප්‍රමාණයක් විශේෂිත නොවන පටි පෙන්වීමට පහසුය.ATGC වඩාත් හොඳින් අහඹු ලෙස බෙදා හරිනු ලැබේ, පියුරීන් හෝ පිරමිඩීන් නියුක්ලියෝටයිඩ 5 ට වඩා වැඩි පොකුරු වළක්වයි.ස්ථායීතාවය වැඩි කිරීම සඳහා 5′ අන්තය සහ අතරමැදි අනුපිළිවෙල සඳහා බහු-gc, 3′ අන්තයේ පොහොසත් GC වළක්වා ගැනීම, අවසාන පාද 3 සඳහා GC නැත, නැතහොත් අවසාන 5 න් 3 සඳහා GC නැත.
4. ප්‍රයිමර් වල ද්විතියික ව්‍යුහයෙන් වළකින්න, සහ ප්‍රයිමර් දෙකක් අතර අනුපූරකයෙන් වළකින්න, විශේෂයෙන් 3 'අවසානයේ අනුපූරකය, එසේ නොමැතිනම් ප්‍රයිමර් ඩයිමර් සෑදී විශේෂිත නොවන විස්තාරණ කලාප ජනනය වේ.
5. යුගල නොකළ පර්යන්ත භෂ්ම හේතුවෙන් PCR අසමත් වීම වළක්වා ගැනීම සඳහා ප්‍රයිමර් වල 3 'අවසානයේ ඇති පාද, විශේෂයෙන් අවසාන සහ අවසාන පාද, දැඩි ලෙස යුගල කළ යුතුය.
6. ප්‍රයිමර්වලට යෝග්‍ය බෙදුම් ස්ථාන ඇති හෝ එකතු කළ හැකි අතර, විස්තාරණය කරන ලද ඉලක්ක අනුපිළිවෙලට වඩාත් සුදුසු බෙදුම් ස්ථාන තිබිය යුතුය, එය බෙදීම් විශ්ලේෂණයට හෝ අණුක ක්ලෝනකරණයට ඉතා ප්‍රයෝජනවත් වේ.
7. ප්‍රයිමර් වල විශේෂත්වය: ප්‍රයිමර් වලට න්යෂ්ටික අම්ල අනුක්‍රමික දත්ත ගබඩාවේ අනෙකුත් අනුපිළිවෙලවල් සමග පැහැදිලි සමජාතීයත්වයක් නොතිබිය යුතුය.
8. මෘදුකාංග භාවිතා කිරීමට ඉගෙන ගන්න: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (මෙම සබැඳි සැලසුම වඩාත් හොඳින් ක්‍රියා කරයි).
ඉහත අන්තර්ගතයට ප්රාථමික සැලසුම් ගැටළු වලින් අවම වශයෙන් 99% ක් විසඳිය හැක.
ප්‍රයිමර් නිර්මාණයේ විස්තර පාලනය කරන්න
1. ප්‍රයිමර් දිග
සාමාන්‍ය ප්රාථමික දිග 18-30 පදනම් වේ.සාමාන්‍යයෙන්, ප්‍රාථමිකයේ ඇනීලිං උෂ්ණත්වය තීරණය කරන වැදගත්ම සාධකය වන්නේ ප්‍රාථමිකයේ දිගයි.ප්‍රයිමරයේ ඇනීලිං උෂ්ණත්වය සාමාන්‍යයෙන් තෝරා ගනු ලැබේ (Tm අගය -5℃), සමහරක් සෘජුවම Tm අගය භාවිතා කරයි.ප්‍රයිමර් වල ඇනීලිං උෂ්ණත්වය දළ වශයෙන් ගණනය කිරීමට පහත සූත්‍ර භාවිතා කළ හැක.
ප්‍රාථමිකයේ දිග 20bp ට වඩා අඩු වූ විට: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
ප්‍රාථමිකයේ දිග 20bp ට වඩා වැඩි වූ විට: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/දිග-5℃
මීට අමතරව, බොහෝ මෘදුකාංග ද නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය ගණනය කිරීම සඳහා භාවිතා කළ හැකිය, ගණනය කිරීමේ මූලධර්මය වෙනස් වනු ඇත, එබැවින් සමහර විට ගණනය කළ අගය කුඩා පරතරයක් තිබිය හැක.PCR ප්රතික්රියා ප්‍රශස්ත කිරීම සඳහා, 54℃ ට නොඅඩු උෂ්ණත්වය සහතික කරන කෙටිම ප්‍රයිමර් හොඳම කාර්යක්ෂමතාව සහ විශේෂත්වය සඳහා භාවිතා කෙරේ.
සමස්තයක් වශයෙන්, එක් එක් අතිරේක නියුක්ලියෝටයිඩ සඳහා ප්රාථමික විශේෂත්වය හතර ගුණයකින් වැඩි වන අතර, බොහෝ යෙදුම් සඳහා අවම ප්රාථමික දිග නියුක්ලියෝටයිඩ 18 කි.ප්රාථමික දිගේ ඉහළ සීමාව ඉතා වැදගත් නොවේ, ප්‍රධාන වශයෙන් ප්රතික්රියා කාර්යක්ෂමතාවයට සම්බන්ධ වේ.එන්ට්‍රොපිය නිසා, ප්‍රාථමිකය දිගු වන තරමට, එය DNA පොලිමරේස් බන්ධනය සඳහා ස්ථායී ද්විත්ව නූල් සැකිල්ලක් සෑදීමට ඉලක්කගත DNA සමඟ බැඳීමට අනුවර්තනය වන වේගය අඩු වේ.
ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීම සඳහා මෘදුකාංග භාවිතා කරන විට, ප්‍රයිමර් වල දිග TM අගය අනුව තීරණය කළ හැක, විශේෂයෙන් ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR ප්‍රයිමර් සඳහා, TM=60℃ හෝ පාලනය කළ යුතුය.
2.GC අන්තර්ගතය
සාමාන්‍යයෙන්, ප්රාථමික අනුපිළිවෙලෙහි G+C හි අන්තර්ගතය 40%~60% වන අතර, ප්‍රයිමර් යුගලයක GC අන්තර්ගතය සහ Tm අගය සම්බන්ධීකරණය කළ යුතුය.ප්‍රයිමරයට බරපතල GC හෝ AT ප්‍රවණතාවක් තිබේ නම්, ප්‍රාථමිකයේ 5' අන්තයට සුදුසු A, T හෝ G සහ C වලිගය එක් කළ හැක.
3. උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය
නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය නොකැඩෙන උෂ්ණත්වයට වඩා 5℃ අඩු විය යුතුය.ප්රාථමික භෂ්ම සංඛ්යාව කුඩා නම්, ඇනීලිං උෂ්ණත්වය යෝග්‍ය ලෙස වැඩි කළ හැකි අතර එමඟින් PCR හි විශේෂත්වය වැඩි කළ හැක.භෂ්ම ගණන විශාල නම්, උච්චාවචන උෂ්ණත්වය සුදුසු ලෙස අඩු කළ හැකිය.4℃ ~ 6℃ ප්‍රයිමර් යුගලයක් අතර ඇති නිර්වින්දන උෂ්ණත්ව වෙනස PCR අස්වැන්නට බලපාන්නේ නැත, නමුත් ඉතා මැනවින් ප්‍රයිමර් යුගලයක නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය සමාන වේ, එය 55℃ ~ 75℃ අතර වෙනස් විය හැක.
4. විස්තාරණ අච්චුවේ ද්විතියික ව්‍යුහ ප්‍රදේශයෙන් වළකින්න
විස්තාරණය කරන ලද කොටස තෝරාගැනීමේදී අච්චුවේ ද්විතියික ව්‍යුහ කලාපයෙන් වැළකී සිටීම වඩාත් සුදුසුය.ඉලක්ක ඛණ්ඩයේ ස්ථායී ද්විතියික ව්යුහය අදාළ පරිගණක මෘදුකාංග මගින් පුරෝකථනය කර ඇස්තමේන්තු කළ හැකි අතර, එය සැකිලි තෝරාගැනීම සඳහා උපකාරී වේ.පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කරන්නේ පුළුල් කළ යුතු කලාපයේ නිදහස් ශක්තිය (△G) 58.6lkJ/mol ට වඩා අඩු වූ විට ප්‍රසාරණය බොහෝ විට අසාර්ථක වන බවයි.
5. ඉලක්කගත DNA සමග නොගැලපීම
විස්තාරණය කරන ලද ඉලක්ක DNA අනුක්‍රමය විශාල වන විට, ප්‍රාථමිකයක් ඉලක්කගත DNA වල බහුවිධ කොටස්වලට බන්ධනය විය හැක, ප්‍රතිඵලය තුළ බහු පටි දිස්වේ.මෙවර BLAST මෘදුකාංග පරීක්ෂාව, වෙබ් අඩවිය භාවිතා කිරීම අවශ්ය වේ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.අනුපිළිවෙලවල් දෙකක් (bl2seq) පෙළගස්වන්න තෝරන්න.
කලාප 1 වෙත ප්රාථමික අනුපිළිවෙලවල් ඇලවීම සහ කලාප 2 වෙත ඉලක්කගත DNA අනුපිළිවෙල එකිනෙකට හුවමාරු කළ හැකි අතර, BLAST අනුපූරක, ප්‍රතිදේහජනක සහ වෙනත් හැකියාවන් ගණනය කරයි, එබැවින් පරිශීලකයන් දාම දෙකම සංවේදී දාමයන්දැයි දැන ගැනීමට අවශ්ය නොවේ.දත්ත ගබඩාවේ ඇති අනුපිළිවෙලෙහි GI අංකය ඔබ දන්නේ නම් ඔබට GI අංකය ඇතුළත් කළ හැකිය, එබැවින් ඔබට අනුක්‍රමයේ විශාල කොටසක් ඇලවිය යුතු නැත.අවසාන වශයෙන්, ඉලක්කගත DNA තුළ ප්‍රාථමිකයේ බහු සමජාතීය අඩවි තිබේදැයි බැලීමට 3 හි පෙළගස්වන්න ක්ලික් කරන්න.
6. ප්‍රයිමර් පර්යන්තය
ප්‍රාථමිකයේ 3 'අවසානය දිගුව ආරම්භ වන ස්ථානයයි, එබැවින් නොගැලපීම් එතැනින් ආරම්භ වීම වැළැක්වීම වැදගත් වේ.3 'අවසානය අඛණ්ඩව G හෝ C 3 ට වඩා වැඩි නොවිය යුතුය, මන්ද මෙය G+C පොහොසත් කිරීමේ අනුක්‍රමික කලාපය තුළ ප්‍රාථමිකය වැරදීමකින් ක්‍රියා විරහිත වීමට හේතු වනු ඇත.විශේෂ PCR (AS-PCR) ප්රතික්රියා හැර, 3' අන්තයට කිසිදු ද්විතියික ව්‍යුහයක් සෑදිය නොහැක, ප්‍රාථමිකයේ 3′ අන්තය නොගැලපේ.උදාහරණයක් ලෙස, කේතීකරණ කලාපය විස්තාරණය කර ඇත්නම්, කෝඩෝනයේ තුන්වන ස්ථානයේදී ප්‍රාථමිකයේ 3 'අවසානය අවසන් නොකළ යුතුය, මන්ද කෝඩෝනයේ තුන්වන ස්ථානය පරිහානියට නැඹුරු වන අතර එය විස්තාරණයේ විශේෂත්වයට සහ කාර්යක්ෂමතාවයට බලපානු ඇත.ඇමුණුම් ප්රාථමික භාවිතා කරන විට, කෝඩෝන භාවිත වගුව වෙත යොමු වන්න, ජීව විද්‍යාත්මක මනාපයන් වෙත අවධානය යොමු කරන්න, 3′ අන්තයේ ඇමුණුම් ප්‍රයිමර් භාවිතා නොකරන්න, සහ ප්රාථමික සාන්ද්රණය වැඩි (1uM-3uM) භාවිතා කරන්න.
7. ප්‍රයිමර් වල ද්විතියික ව්යුහය
ප්‍රයිමර්වලටම අනුපූරක අනුපිළිවෙලක් නොතිබිය යුතුය, එසේ නොමැතිනම් ප්‍රයිමර් විසින්ම හිසකෙස් ව්‍යුහයන්ට නැමෙනු ඇති අතර, මෙම ද්විතියික ව්යුහය ස්ටීරික් බාධාව හේතුවෙන් ප්‍රයිමර් සහ සැකිලි බන්ධනයට බලපානු ඇත.කෘතිම විනිශ්චය භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රයිමර් වල අඛණ්ඩ අනුපූරක පදනම 3bp ට වඩා වැඩි නොවිය යුතුය.ප්‍රයිමර් දෙක අතර අනුපූරකතාවයක් නොතිබිය යුතුය, විශේෂයෙන් ප්‍රයිමර් ඩිමර් සෑදීම වැළැක්වීම සඳහා 3 'අන්තයේ අනුපූරක අතිච්ඡාදනය වැළැක්විය යුතුය.සාමාන්‍යයෙන්, ප්‍රයිමර් යුගලයක් අතර අඛණ්ඩ පාද සමජාතීය හෝ අනුපූරක 4කට වඩා නොතිබිය යුතුය.
8. සලකුණු හෝ ස්ථාන එකතු කරන්න
5 'අවසානය විස්තාරණ විශේෂත්වයට සුළු බලපෑමක් ඇති කරන අතර එබැවින් විස්තාරණ විශේෂත්වයට බලපෑම් නොකර වෙනස් කළ හැක.ප්‍රයිමර් 5 'අවසානයේ වෙනස් කිරීම ඇතුළත් විය: එන්සයිම සීමා කිරීමේ අඩවිය එකතු කිරීම;ලේබල් කරන ලද biotin, fluorescence, digoxin, Eu3+, ආදිය. ප්‍රෝටීන් බන්ධන DNA අනුපිළිවෙල හඳුන්වා දෙන්න;විකෘති අඩවි හඳුන්වාදීම, විකෘති අනුපිළිවෙල ඇතුළත් කිරීම සහ නැතිවීම සහ ප්‍රවර්ධක අනුපිළිවෙල හඳුන්වාදීම යනාදිය. අමතර පදනම් විස්තාරණය කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාවයට අඩු වැඩි වශයෙන් බලපාන අතර ප්‍රයිමර් ඩිමර් සෑදීමේ අවස්ථාව වැඩි කරයි, නමුත් ඊළඟ පියවර සඳහා යම් සහන ලබා දිය යුතුය.සීමා කිරීම් අඩවි සහ ප්‍රවර්ධක අනුපිළිවෙල වැනි ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි නොපවතින අතිරේක අනුපිළිවෙලවල්, විශේෂිතත්වයට බල නොපාමින් ප්‍රාථමිකයේ 5′ කෙළවරට එක් කළ හැක.මෙම අනුපිළිවෙල ප්රාථමික Tm අගයන් ගණනය කිරීමේදී ඇතුළත් නොවේ, නමුත් අනුපූරකතාව සහ අභ්‍යන්තර ද්විතියික ව්යුහය සඳහා පරීක්ෂා කළ යුතුය.
9. උපක්ලෝන
බොහෝ විට, PCR යනු ප්රාථමික ක්ලෝනකරණයක් පමණක් වන අතර, පසුව අපට ඉලක්කගත කොටස විවිධ දෛශිකවලට උපක්ලෝන කිරීමට අවශ්ය වේ, එබැවින් අපි PCR පියවරේදී මීළඟ මෙහෙයුම සඳහා අමතර කඳවුරු නිර්මාණය කළ යුතුය.
උපක්ලෝන කිරීම සඳහා නිර්මාණය කර ඇති සමහර අනුපිළිවෙලවල් පහත සාරාංශගත කර ඇත.
සීමා කිරීම් endonuclease සීමා අඩවිය එකතු කරන ලදී
PCR නිෂ්පාදන උපක්ලෝන කිරීම සඳහා බහුලව භාවිතා වන ක්රමය වන්නේ එන්සයිම සීමා කිරීම් අඩවි එකතු කිරීමයි.සාමාන්‍යයෙන්, ක්ලේවේජ් අඩවිය භෂ්ම හයකින් යුක්ත වන අතර, බෙදුම් අඩවියේ කෙළවර 5 ට අමතරව ආරක්ෂිත භෂ්ම 2 ~ 3 ක් එකතු කළ යුතුය.කෙසේ වෙතත්, විවිධ එන්සයිම සඳහා අවශ්ය ආරක්ෂිත භෂ්ම සංඛ්යාව වෙනස් වේ.උදාහරණයක් ලෙස, SalⅠ සඳහා ආරක්ෂිත පදනමක් අවශ්ය නොවේ, EcoRⅤ සඳහා ආරක්ෂිත පදනමක් අවශ්ය වේ, NotⅠ සඳහා ආරක්ෂිත කඳවුරු 2ක් අවශ්ය වේ, සහ Hind Ⅲ සඳහා ආරක්ෂිත කඳවුරු 3ක් අවශ්ය වේ.
LIC වලිගය එකතු කරයි
LIC හි සම්පූර්ණ නම Ligation-Independent cloning වේ, එය pET දෛශිකයේ කොටස සඳහා විශේෂයෙන් Navogen විසින් සොයා ගන්නා ලද ක්ලෝනකරණ ක්රමයකි.LIC ක්රමය මඟින් සකස් කරන ලද pET වාහකයේ අනුපූරක නොවන 12-15 පාදක තනි කෙඳි ඇලෙන සුළු කෙළවරක් ඇති අතර, එය ඉලක්ක ඇතුළු කිරීමේ කොටසෙහි අනුරූප ඇලෙන සුළු කෙළවරට අනුපූරක වේ.විස්තාරණ අරමුණු සඳහා, ඇතුල් කරන ලද කොටසෙහි ප්රාථමික 5′ අනුපිළිවෙල LIC දෛශිකය සමඟ අනුපූරක විය යුතුය.T4 DNA පොලිමරේස් හි 3′→5′ නිස්සාරක ක්‍රියාකාරීත්වය කෙටි කාලයකින් පසු ඇතුල් කරන ලද කොටසෙහි තනි කෙඳි ඇලෙන සුළු කෙළවරක් සෑදිය හැක.නිෂ්පාදිතය සෑදිය හැක්කේ සකස් කරන ලද ඇතුල් කිරීමේ ඛණ්ඩනයේ සහ දෛශිකයේ අන්‍යෝන්‍ය ඇනලින් කිරීමෙන් පමණක් බැවින්, මෙම ක්රමය ඉතා වේගවත් හා කාර්යක්ෂම වන අතර එය ක්ලෝනකරණයට යොමු කෙරේ.
අධ්‍යක්ෂණය කරන ලද TA ක්ලෝනය ඇඩ් ටේල්
TA ක්ලෝනකරණයට ඛණ්ඩනය දෛශිකයක් බවට පත් කිරීමට නොහැකි විය, එබැවින් පසුව Invitrogen විසින් ක්ලෝනකරණය ඉලක්ක කළ හැකි දෛශිකයක් හඳුන්වා දෙන ලදී, එහි එක් කෙළවරක ප්‍රමුඛ GTGGS හතරක් අඩංගු විය.එබැවින්, PCR ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීමේදී, අනුපූරක අනුපිළිවෙලවල් ඒ අනුව එකතු කළ යුතුය, එවිට කොටස් “දිශානත” කළ හැකිය.
ඔබට කාලය අඩු නම්, ඔබට ජානය දෛශිකය සමඟ ඒකාබද්ධ කරමින් සෘජු සංස්ලේෂණය උත්සාහ කළ හැකිය, එය අපි musecularists තුළ ET ජාන සංස්ලේෂණය ලෙස හඳුන්වමු.
D. In-Fusion ක්ලෝන ක්රමය
ලිගස් අවශ්ය නොවේ, දිගු ප්රතික්රියාවක් අවශ්ය නොවේ.ප්‍රයිමර් නිර්මාණයේදී රේඛීය දෛශිකයේ දෙපස අනුපිළිවෙලක් හඳුන්වා දෙන තාක්, PCR නිෂ්පාදනය සහ රේඛීය දෛශිකය BSA අඩංගු ඉන්-ෆියුෂන් එන්සයිම ද්‍රාවණයට එකතු කර පැය භාගයක් කාමර උෂ්ණත්වයේ තබන තාක්, පරිවර්තනය සිදු කළ හැක.මෙම ක්රමය විශාල පරිමාව පරිවර්තනය සඳහා විශේෂයෙන් සුදුසු වේ.
10. ප්‍රාථමිකය ඒකාබද්ධ කරන්න
සමහර විට, ප්‍රයිමර් නිර්මාණය ගැන දන්නේ සීමිත අනුක්‍රමික තොරතුරු පමණි.උදාහරණයක් ලෙස, ඇමයිනෝ අම්ල අනුපිළිවෙල පමණක් දන්නේ නම්, ඒකාබද්ධ කිරීමේ ප්‍රාථමිකය නිර්මාණය කළ හැකිය.ඒකාබද්ධ ප්‍රාථමිකයක් යනු තනි ඇමයිනෝ අම්ලයක් කේතනය කරන විවිධ පාදක හැකියාවන් නියෝජනය කරන විවිධ අනුක්‍රමික මිශ්‍රණයකි.නිශ්චිතභාවය වැඩි කිරීම සඳහා, විවිධ ජීවීන්ගේ මූලික භාවිත මනාපයන් අනුව ඇමුණුම අඩු කිරීම සඳහා ඔබට කෝඩෝන භාවිත වගුව වෙත යොමු විය හැක.ප්‍රාථමිකයේ උෂ්නත්වය අඩු කිරීම සඳහා හයිපොක්සැන්තයින් සියලුම භෂ්ම සමඟ යුගල කළ හැක.ප්‍රයිමරයේ 3′ අන්තයේ ඇනෙක්ස් කරන ලද භෂ්ම භාවිතා නොකරන්න, මන්ද 3′ අන්තයේ ඇති අවසාන භෂ්ම 3 ඇනීල් කිරීම වැරදි ස්ථානයේ PCR ආරම්භ කිරීමට ප්‍රමාණවත් වේ.වැඩි ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයන් (1μM සිට 3μM) භාවිතා කරනුයේ බොහෝ ඇමුණුම් මිශ්‍රණවල ප්‍රයිමර් ඉලක්ක අච්චුවට විශේෂිත නොවන බැවිනි.
PCR අමුද්රව්යපාලනය
1. ප්රාථමික ප්‍රමාණය
එක් එක් ප්‍රාථමිකයේ සාන්ද්රණය 0.1 ~ 1umol හෝ 10 ~ 100pmol වේ.ප්‍රාථමිකයේ අවම ප්‍රමාණය සමඟ අවශ්ය ප්‍රති result ලය නිෂ්පාදනය කිරීම වඩා හොඳය.ප්‍රාථමිකයේ ඉහළ සාන්ද්රණය නොගැලපීම සහ නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය ඇති කරයි, සහ ප්‍රයිමර් අතර ඩිමර් සෑදීමේ අවස්ථාව වැඩි කරයි.
2. ප්රාථමික සාන්ද්රණය
ප්‍රයිමර්වල සාන්ද්රණය විශේෂත්වයට බලපායි.ප්‍රශස්ත ප්රාථමික සාන්ද්රණය සාමාන්‍යයෙන් 0.1 සහ 0.5μM අතර වේ.ඉහළ ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයන් නිශ්චිත නොවන නිෂ්පාදන විස්තාරණය කිරීමට හේතු වේ.
3. ප්‍රයිමරයේ ඇනලීං උෂ්ණත්වය
ප්‍රයිමර් සඳහා තවත් වැදගත් පරාමිතියක් වන්නේ දියවන උෂ්ණත්වය (Tm) ය.ප්රාථමික සහ අනුපූරක අනුපිළිවෙලින් 50% ද්විත්ව නූල් DNA අණු ලෙස නිරූපණය වන විට මෙය උෂ්ණත්වය වේ.PCR annealing උෂ්ණත්වය සැකසීමට Tm අවශ්ය වේ.ඉතා මැනවින්, නිර්වචන උෂ්ණත්වය ඉලක්ක අනුපිළිවෙල සමඟ ප්‍රයිමර් වල ඵලදායි විනිමය සහතික කිරීමට ප්‍රමාණවත් තරම් අඩු නමුත් නිශ්චිත නොවන බන්ධන අඩු කිරීමට ප්‍රමාණවත් වේ.55℃ සිට 70℃ දක්වා සාධාරණ නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය.ඇනීලිං උෂ්ණත්වය සාමාන්‍යයෙන් ප්‍රාථමිකයේ Tm ට වඩා 5℃ අඩුවෙන් සකසා ඇත.
Tm සැකසීම සඳහා සූත්‍ර කිහිපයක් ඇත, ඒවා භාවිතා කරන සූත්‍රය සහ ප්‍රයිමර් අනුපිළිවෙල අනුව බොහෝ සෙයින් වෙනස් වේ.බොහෝ සූත්‍ර ඇස්තමේන්තුගත Tm අගයක් සපයන බැවින්, සියලු ඇනීලිං උෂ්ණත්වයන් ආරම්භක ලක්ෂ්‍යයක් පමණි.ප්‍රගතිශීලී උෂ්ණත්වය ඉහළ නංවන ප්රතික්රියා කිහිපයක් විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් විශේෂත්වය වැඩි දියුණු කළ හැක.ඇස්තමේන්තුගත Tm-5℃ ට වඩා පහළින් ආරම්භ කරන්න, සහ 2℃ වර්ධකයකින් ඇනීලිං උෂ්ණත්වය ක්‍රමයෙන් වැඩි කරන්න.ඉහළ නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය ප්රාථමික ඩයිමර් සහ විශේෂිත නොවන නිෂ්පාදන සෑදීම අඩු කරයි.හොඳම ප්‍රතිඵල සඳහා, ප්රාථමික දෙකෙහි ආසන්න Tm අගයන් තිබිය යුතුය.ප්‍රයිමර් යුගලවල Tm වෙනස 5℃ ට වඩා වැඩි නම්, ප්‍රයිමර් චක්‍රයේ අඩු උෂ්නත්ව උෂ්ණත්වයක් භාවිතා කිරීමෙන් සැලකිය යුතු ව්‍යාජ ආරම්භයක් පෙන්වයි.ප්රාථමික Tm දෙක වෙනස් නම්, ඇනීලිං උෂ්ණත්වය අඩුම Tm ට වඩා 5℃ දක්වා අඩු කරන්න.විකල්පයක් ලෙස, නිශ්චිතභාවය වැඩි කිරීම සඳහා, වැඩි Tm සඳහා නිර්මාණය කර ඇති නිර්වින්දන උෂ්ණත්වවලදී ප්‍රථමයෙන් චක්‍ර පහක් සිදු කළ හැකි අතර, පසුව අඩු Tm සඳහා නිර්මාණය කර ඇති නිර්වින්දන උෂ්ණත්වවලදී ඉතිරි චක්‍ර සිදු කළ හැක.මෙමගින් ගමනාන්ත ආකෘතියේ අර්ධ පිටපතක් දැඩි තත්ව යටතේ ලබා ගැනීමට ඉඩ සලසයි.
4. ප්රාථමික සංශුද්ධතාවය සහ ස්ථාවරත්වය
බොහෝ PCR යෙදුම් සඳහා අභිරුචි ප්‍රයිමර් වල සම්මත සංශුද්ධතාවය ප්‍රමාණවත් වේ.desalting මගින් benzoyl සහ isobutylyl කණ්ඩායම් ඉවත් කිරීම අවම වන අතර එම නිසා PCR වලට බාධා නොකරයි.සංශ්ලේෂණ ක්‍රියාවලියේදී සම්පූර්ණ දිග නොවන අනුපිළිවෙලක් ඉවත් කිරීමට සමහර යෙදුම් වලට පිරිසිදු කිරීම අවශ්ය වේ.DNA සංශ්ලේෂණ රසායන විද්‍යාවේ කාර්යක්ෂමතාව 100% ක් නොවන නිසා මෙම කප්පාදු කරන ලද අනුපිළිවෙලවල් ඇතිවේ.මෙය 3′ සිට 5′ දක්වා DNA සෑදීමට එක් එක් භෂ්ම එකතු කරන බැවින් නැවත නැවතත් රසායනික ප්රතික්රියා භාවිතා කරන වෘත්තාකාර ක්‍රියාවලියකි.ඔබට ඕනෑම චක්‍රයකදී අසමත් විය හැක.දිගු ප්‍රයිමර්, විශේෂයෙන් පාද 50 ට වඩා වැඩි ඒවා, කපා දැමූ අනුපිළිවෙලවල් විශාල ප්‍රමාණයක් ඇති අතර පිරිසිදු කිරීම අවශ්ය විය හැකිය.
ප්‍රයිමර් වල අස්වැන්න කෘතිම රසායන විද්‍යාවේ සහ පවිත්‍ර කිරීමේ ක්‍රමයේ කාර්යක්ෂමතාවයෙන් බලපායි.Cytology සහ Shengong වැනි ජෛව ඖෂධ සමාගම්, oligonucleoside හි සම්පූර්ණ නිමැවුම සහතික කිරීම සඳහා අවම OD ඒකකයක් භාවිතා කරයි.අභිරුචි ප්‍රයිමර් වියළි කුඩු ආකාරයෙන් යවනු ලැබේ.අවසාන සාන්ද්රණය 100μM වන පරිදි TE හි ප්‍රයිමර් නැවත විසුරුවා හැරීම වඩාත් සුදුසුය.ජලයේ pH අගය බොහෝ විට ආම්ලික වන අතර ඔලිගොනියුක්ලියෝසයිඩ්වල ජල විච්ඡේදනය ඇති කරන බැවින් ටීඊ ඩයෝනීකරණය කළ ජලයට වඩා හොඳය.
ප්‍රයිමර් වල ස්ථායිතාව ගබඩා තත්වයන් මත රඳා පවතී.වියළි කුඩු සහ විසුරුවා හරින ලද ප්‍රයිමර් -20 ℃ හි ගබඩා කළ යුතුය.10μM ට වැඩි සාන්ද්‍රණයකදී TE හි දියකර ඇති ප්‍රයිමර් මාස 6ක් සඳහා -20℃ හි ස්ථායීව ගබඩා කළ හැකි නමුත් සති 1කට අඩු කාලයක් කාමර උෂ්ණත්වයේ (15℃ සිට 30℃ දක්වා) පමණක් ගබඩා කළ හැක.වියළි කුඩු ප්‍රයිමර් අවම වශයෙන් වසර 1 ක් සඳහා -20 C දී සහ කාමර උෂ්ණත්වයේ (15 C සිට 30 C දක්වා) මාස 2 දක්වා ගබඩා කළ හැකිය.
5. එන්සයිම සහ ඒවායේ සාන්ද්රණය
වර්තමානයේ, Taq DNA පොලිමරේස් භාවිතා කරනු ලබන්නේ මූලික වශයෙන් coliform බැක්ටීරියාව මගින් සංස්ලේෂණය කරන ලද ජාන ඉංජිනේරු එන්සයිමය වේ.සාමාන්‍ය PCR ප්රතික්රියාවක් උත්ප්‍රේරණය කිරීමට අවශ්ය එන්සයිම ප්‍රමාණය 2.5U පමණ වේ (මුළු ප්රතික්රියා පරිමාව 100ul වෙත යොමු කරයි).සාන්ද්රණය ඉතා ඉහළ නම්, එය විශේෂිත නොවන විස්තාරණයකට තුඩු දිය හැකිය;සාන්ද්රණය ඉතා අඩු නම්, කෘතිම නිෂ්පාදනයේ ප්‍රමාණය අඩු වේ.
6. dNTP හි ගුණාත්මකභාවය සහ සාන්ද්රණය
dNTP හි ගුණාත්මක භාවය PCR විස්තාරණයේ සාන්ද්රණය සහ කාර්යක්ෂමතාවයට සමීපව සම්බන්ධ වේ.dNTP කුඩු කැටිති වන අතර, එය අනිසි ලෙස ගබඩා කර ඇත්නම් එහි විචල්‍යතාවය එහි ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් නැති වේ.dNTP ද්‍රාවණය ආම්ලික වන අතර, 1M NaOH හෝ 1M Tris.HCL බෆර ද්‍රාවණය සමඟ එහි PH අගය 7.0 ~ 7.5 දක්වා, කුඩා උප-ඇසුරුම් ප්‍රමාණයක්, -20℃ හි ශීත කළ ගබඩාව සකස් කිරීම සඳහා ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් භාවිතා කළ යුතුය.බහු කැටි-උණුවීම dNTP හායනය කරයි.PCR ප්‍රතික්‍රියාවේදී, dNTP 50 ~ 200umol/L විය යුතුය.විශේෂයෙන්ම, DNTPS හතරේ සාන්ද්රණය සමාන විය යුතුය (සමාන මවුලය සකස් කිරීම) අවධානය යොමු කළ යුතුය.ඒවායින් එකක සාන්ද්රණය අනෙක් ඒවාට වඩා වෙනස් නම් (ඉහළ හෝ පහළ) නොගැලපීම ඇතිවේ.ඉතා අඩු සාන්ද්රණය PCR නිෂ්පාදනවල අස්වැන්න අඩු කරයි.dNTP හට Mg2+ සමඟ සම්බන්ධ වී නිදහස් Mg2+ සාන්ද්රණය අඩු කළ හැක.
7. සැකිල්ල (ඉලක්ක ජානය) න්යෂ්ටික අම්ලය
අච්චු නියුක්ලෙයික් අම්ලයේ ප්‍රමාණය සහ පිරිසිදු කිරීමේ මට්ටම PCR හි සාර්ථකත්වය හෝ අසාර්ථකත්වය සඳහා වන ප්‍රධාන සබැඳිවලින් එකකි.සාම්ප්‍රදායික DNA පිරිසිදු කිරීමේ ක්‍රම සාමාන්‍යයෙන් නියැදි දිරවීමට සහ බැහැර කිරීමට SDS සහ protease K භාවිතා කරයි.SDS හි ප්‍රධාන කාර්යයන් වනුයේ: සෛල පටලය මත ලිපිඩ සහ ප්‍රෝටීන ද්‍රාවණය කිරීම, එමගින් පටල ප්‍රෝටීන දියකර සෛල පටලය විනාශ කිරීම සහ සෛලය තුළ න්යෂ්ටික ප්‍රෝටීන විඝටනය කිරීම, SDS හට ප්‍රෝටීන සමඟ ඒකාබද්ධ වී වර්ෂාපතනය කළ හැක;Protease K හට ප්‍රෝටීන ජල විච්ඡේදනය කර දිරවා ගත හැක, විශේෂයෙන් DNA සමඟ බැඳී ඇති histones, පසුව ප්‍රෝටීන සහ අනෙකුත් සෛල සංරචක නිස්සාරණය කිරීම සඳහා කාබනික ද්‍රාවක phenol සහ chloroform භාවිතා කරයි, සහ න්යෂ්ටික අම්ලය අවක්ෂේප කිරීම සඳහා එතනෝල් හෝ isopropyl මධ්යසාර භාවිතා කරයි.නිස්සාරණය කරන ලද න්යෂ්ටික අම්ලය PCR ප්රතික්රියා සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කළ හැක.සාමාන්‍ය සායනික හඳුනාගැනීමේ නිදර්ශක සඳහා, ඉක්මන් හා සරල ක්රමයක් මගින් සෛල විසුරුවා හැරීම, ලයිසේට් රෝග කාරක, දිරවීමට සහ වර්ණදේහ වලින් ප්‍රෝටීන නිදහස් ඉලක්ක ජාන දක්වා ඉවත් කිරීමට සහ PCR විස්තාරණය සඳහා සෘජුවම භාවිතා කළ හැක.RNA අච්චු නිස්සාරණය සාමාන්‍යයෙන් RNase RNA හායනය වීම වැළැක්වීමට guanidine isothiocyanate හෝ protease K ක්රමය භාවිතා කරයි.
8.Mg2+ සාන්ද්රණය
Mg2+ PCR විස්තාරණයේ විශේෂත්වය සහ අස්වැන්න කෙරෙහි සැලකිය යුතු බලපෑමක් ඇත.සාමාන්‍ය PCR ප්‍රතික්‍රියාවේදී, විවිධ dNTP සාන්ද්රණය 200umol/L වන විට, Mg2+ හි සුදුසු සාන්ද්රණය 1.5 ~ 2.0mmol/L වේ.Mg2+ සාන්ද්රණය ඉතා ඉහළ ය, ප්රතික්රියා විශේෂත්වය අඩු වේ, නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය සිදු වේ, ඉතා අඩු සාන්ද්රණය Taq DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරිත්වය අඩු කරයි, ප්රතික්රියා නිෂ්පාදන අඩු කිරීමට හේතු වේ.
මැග්නීසියම් අයන අස්වැන්න කෙරෙහි බලපාන DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරකම් වැනි PCR හි අංශ කිහිපයකට බලපායි;තවත් උදාහරණයක් නම් ප්‍රයිමර් ඇනීලින්, එය විශේෂත්වයට බලපායි.dNTP සහ අච්චුව මැග්නීසියම් අයන සමඟ බැඳී, එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් සඳහා අවශ්ය නිදහස් මැග්නීසියම් අයන ප්‍රමාණය අඩු කරයි.විවිධ ප්රාථමික යුගල සහ සැකිලි සඳහා ප්‍රශස්ත මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය වෙනස් වේ, නමුත් සාමාන්‍ය PCR ආරම්භක සාන්ද්රණය 200μM dNTP 1.5mM වේ (සටහන: තත්‍ය කාලීන ප්‍රමාණාත්මක PCR සඳහා, ප්‍රතිදීප්ත පරීක්ෂණයක් සමඟ 3 සිට 5mM මැග්නීසියම් අයන ද්‍රාවණය භාවිතා කරන්න).නිදහස් මැග්නීසියම් අයනවල ඉහළ සාන්ද්රණය අස්වැන්න වැඩි කරයි, නමුත් නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය වැඩි කරයි සහ විශ්වාසවන්තභාවය අඩු කරයි.ප්‍රශස්ත සාන්ද්රණය තීරණය කිරීම සඳහා, මැග්නීසියම් අයන ටයිටරේෂන් 1mM සිට 3mM දක්වා 0.5mM වර්ධක වලින් සිදු කරන ලදී.මැග්නීසියම් අයන ප්‍රශස්තකරණය මත යැපීම අඩු කිරීම සඳහා, ප්ලැටිනම් ටැක් DNA පොලිමරේස් භාවිතා කළ හැකිය.ප්ලැටිනම් ටැක් DNA පොලිමරේස් Taq DNA පොලිමරේස් වලට වඩා පුළුල් පරාසයක මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්‍රණයන් හරහා ක්‍රියාකාරීත්වය පවත්වා ගැනීමට සමත් වන අතර එම නිසා අඩු ප්‍රශස්තකරණයක් අවශ්ය වේ.
9. Pcr-ප්‍රවර්ධනය කරන අතිෙර්ක
බොහෝ සැකිලිවල ඉතා නිශ්චිත විස්තාරණය සඳහා ඇනීලිං උෂ්ණත්වය, ප්රාථමික සැලසුම සහ මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය ප්‍රශස්ත කිරීම ප්‍රමාණවත් වේ;කෙසේ වෙතත්, ඉහළ GC අන්තර්ගතයක් සහිත සමහර සැකිලි සඳහා අමතර පියවර අවශ්ය වේ.DNA වල දියවන උෂ්ණත්වයට බලපාන ආකලන නිෂ්පාදන විශේෂත්වය සහ අස්වැන්න වැඩි දියුණු කිරීමට තවත් ක්රමයක් සපයයි.හොඳම ප්‍රතිඵල සඳහා අච්චුව සම්පූර්ණයෙන් ඉවත් කිරීම අවශ්ය වේ.
මීට අමතරව, ද්විතියික ව්යුහය ප්රාථමික බන්ධන සහ එන්සයිම දිගු කිරීම වළක්වයි.
ෆෝමයිඩ්, ඩීඑම්එස්ඕ, ග්ලිසරින්, බීටයින් සහ පීසීආර්එක්ස් එන්හාන්සර් විසඳුම ඇතුළුව PCR ආකලන, විස්තාරණය වැඩි දියුණු කරයි.ඔවුන්ගේ විය හැකි යාන්ත්‍රණය වන්නේ ද්‍රවාංක උෂ්ණත්වය අඩු කිරීමයි, එමඟින් ප්‍රයිමර් ඇනීල් කිරීමට සහ ද්විතියික ව්‍යුහ කලාපය හරහා DNA පොලිමරේස් දිගු කිරීමට සහාය වේ.PCRx විසඳුම වෙනත් වාසි ඇත.Platinum Taq DNA පොලිමරේස් සහ ප්ලැටිනම් Pfx DNA පොලිමරේස් සමඟ භාවිතා කරන විට අවම මැග්නීසියම් අයන ප්‍රශස්තකරණයක් අවශ්ය වේ.මේ අනුව, ප්ලැටිනම් තාක්ෂණය තෙවන ප්‍රවේශය වන මැග්නීසියම් අයන ප්‍රශස්තකරණයේ යැපීම අඩු කරන අතරම නිශ්චිතභාවය වැඩි කිරීම සඳහා ආකලන සමඟ ඒකාබද්ධ වේ.හොඳම ප්‍රතිඵල සඳහා, ආකලනවල සාන්ද්රණය ප්‍රශස්ත කළ යුතුය, විශේෂයෙන් ඩීඑම්එස්ඕ, ෆෝමයිඩ් සහ ග්ලිසරෝල්, ටැක් ඩීඑන්ඒ පොලිමරේස් වළක්වයි.
10. උණුසුම් ආරම්භය
Hot start PCR යනු හොඳ ප්‍රයිමර් නිර්මාණයට අමතරව PCR විශේෂත්වය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා වඩාත් වැදගත් ක්‍රමවලින් එකකි.Taq DNA පොලිමරේස් වල ප්‍රශස්ත දිගු උෂ්ණත්වය 72℃ වුවද, පොලිමරේස් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී ක්‍රියාකාරීව පවතී.මේ අනුව, PCR ප්‍රතික්‍රියාව සැකසීමේදී සහ තාප චක්‍රයේ ආරම්භයේදී රඳවා තබා ගැනීමේ උෂ්ණත්වය ඇනලීං උෂ්ණත්වයට වඩා අඩු වන විට විශේෂිත නොවන නිෂ්පාදන නිපදවනු ලැබේ.සෑදූ පසු, මෙම නිශ්චිත නොවන නිෂ්පාදන ඵලදායී ලෙස වර්ධක කරනු ලැබේ.Hot-start PCR විශේෂයෙන් ඵලදායි වන්නේ ප්රාථමික නිර්මාණය සඳහා භාවිතා කරන අඩවි ප්‍රවේණික මූලද්‍රව්‍යවල පිහිටීමෙන් සීමා වූ විට, එනම් අඩවි-යොමු කරන ලද විකෘති, ප්‍රකාශන ක්ලෝනකරණය, හෝ DNA ඉංජිනේරු විද්‍යාව සඳහා භාවිතා කරන ජාන මූලද්‍රව්‍ය තැනීම සහ හැසිරවීම වැනි ය.
Taq DNA පොලිමරේස් වල ක්‍රියාකාරිත්වය සීමා කිරීමේ පොදු ක්රමයක් වන්නේ අයිස් මත PCR ප්රතික්රියා ද්‍රාවණය සකස් කර පෙර රත් කළ PCR උපකරණයක තැබීමයි.මෙම ක්රමය සරල සහ මිළ අඩුයි, නමුත් එය එන්සයිමයේ ක්‍රියාකාරිත්වය සම්පූර්ණ නොකරන අතර එම නිසා නිශ්චිත නොවන නිෂ්පාදනවල විස්තාරණය සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් නොකරයි.
PCR උපකරණය denaturation උෂ්ණත්වයට ළඟා වන තුරු අත්‍යවශ්‍ය සංරචකයක් නිෂේධනය කිරීමෙන් තාප ප්‍රාථමිකකරණය DNA සංස්ලේෂණය ප්‍රමාද කරයි.Taq DNA පොලිමරේස් ප්‍රමාද වී එකතු කිරීම ඇතුළු බොහෝ අතින් තාප ආරම්භ කිරීමේ ක්‍රම, විශේෂයෙන් ඉහළ කාර්යක්ෂම යෙදුම් සඳහා අපහසු වේ.අනෙකුත් තාප ප්රාථමික ක්‍රම මගින් මැග්නීසියම් අයන හෝ එන්සයිම ඇතුළු අත්‍යවශ්‍ය සංරචකයක් ආවරණය කිරීමට හෝ සැකිලි සහ බෆර වැනි ප්‍රතික්‍රියාශීලී සංරචක භෞතිකව හුදකලා කිරීමට ඉටි ආවරණයක් භාවිතා කරයි.තාප චක්‍රය අතරතුර, විවිධ සංරචක මුදා හරින අතර ඉටි දියවන විට එකට මිශ්‍ර වේ.මැනුවල් හොට් ස්ටාට් ක්රමය මෙන්, ඉටි පලිහ ක්රමය අපහසු වන අතර දූෂණයට ලක් විය හැකි අතර ඉහළ ප්‍රතිදාන යෙදුම් සඳහා සුදුසු නොවේ.
ප්ලැටිනම් DNA පොලිමරේස් ස්වයංක්‍රීය උණුසුම් ආරම්භක PCR සඳහා පහසු සහ කාර්යක්ෂම වේ.ප්ලැටිනම් ටැක් DNA පොලිමරේස් Taq DNA පොලිමරේස් වලට එරෙහිව මොනොක්ලෝනල් ප්‍රතිදේහ සමඟ ඒකාබද්ධ වූ ප්‍රතිසංයෝජන Taq DNA පොලිමරේස් වලින් සමන්විත වේ.ප්‍රතිදේහ PCR මගින් සකස් කර ඇත්තේ දිගු කාලයක් උෂ්ණත්වය රඳවා තබා ගැනීමේදී එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය වළක්වයි.Taq DNA පොලිමරේස් ප්‍රතික්‍රියාවට මුදා හරින ලද්දේ denaturation පියවරේ 94℃ පරිවරණය තුළදී, සම්පූර්ණ පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරිත්වය ප්‍රතිස්ථාපනය කරයි.තාප ආරම්භය සඳහා රසායනිකව වෙනස් කරන ලද Taq DNA පොලිමරේස් වලට ප්‍රතිවිරුද්ධව, ප්ලැටිනම් එන්සයිමයට පොලිමරේස් සක්‍රිය කිරීම සඳහා 94℃ (මිනිත්තු 10 සිට 15 දක්වා) දී දීර්ඝ පරිවරණයක් අවශ්ය නොවේ.PlatinumTaq DNA පොලිමරේස් සමඟින්, Taq DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරකම්වලින් 90%ක් මිනිත්තු 2කට පසු 94℃ දී ප්‍රතිසාධනය කරන ලදී.
11. නෙස්ට්-PCR
නෙස්ටඩ් ප්‍රයිමර් භාවිතයෙන් අනුප්‍රාප්තික වර්ධක වටයකින් නිශ්චිතභාවය සහ සංවේදීතාව වැඩි දියුණු කළ හැක.පළමු වටය චක්‍ර 15 සිට 20 දක්වා සම්මත විස්තාරණයකි.ආරම්භක විස්තාරණ නිෂ්පාදනයේ කුඩා කොටසක් 100 සිට 1000 වාරයක් තනුක කර 15 සිට 20 දක්වා චක්‍ර සඳහා දෙවන වටයේ විස්තාරණයට එකතු කරන ලදී.විකල්පයක් ලෙස, ආරම්භක විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදිතය ජෙල් පිරිපහදු කිරීම මගින් ප්රමාණ කළ හැක.විස්තාරණය කිරීමේ දෙවන වටයේ දී කැදැලි ප්‍රාථමිකයක් භාවිතා කරනු ලැබේ, එය පළමු ප්‍රාථමිකය තුළ ඉලක්ක අනුපිළිවෙලට බැඳිය හැක.ප්‍රයිමර් කට්ටල දෙකටම අනුපූරක ඉලක්ක අනුපිළිවෙලවල් කිහිපයක් ඇති නිසා කැදැලි PCR භාවිතය බහු ඉලක්ක අඩවි විස්තාරණය කිරීමේ හැකියාව අඩු කරයි.එකම ප්‍රයිමර් සමඟ එකම මුළු චක්‍ර ගණන (30 සිට 40 දක්වා) නිශ්චිත නොවන අඩවි විස්තාරණය කළේය.Nested PCR සීමිත ඉලක්ක අනුපිළිවෙලවල් වල සංවේදීතාව වැඩි කරයි (උදා: දුර්ලභ mrnas) සහ දුෂ්කර PCRS වල විශේෂත්වය (උදා: 5′ RACE) වැඩි දියුණු කරයි.
12. අවරෝහණ PCR
PCR හි පළමු චක්‍ර කිහිපය සඳහා දැඩි ඇනලීං තත්ත්‍වයන් භාවිතා කිරීමෙන් PCR අවරෝහණය වැඩි දියුණු කරයි.චක්‍රය ආරම්භ වන්නේ ඇස්තමේන්තුගත Tm ට වඩා දළ වශයෙන් 5℃ ඉහළ ඇනීලිං උෂ්ණත්වයකදීය, එවිට සෑම චක්‍රයක්ම 1℃ සිට 2℃ දක්වා අඩු කරනු ලැබේ, එම උෂ්ණත්වය Tm 5℃ ට අඩු වන තෙක්.ඉහළම සමජාතීය සහිත ගමනාන්ත අච්චුව පමණක් විස්තාරණය කරනු ලැබේ.මෙම නිෂ්පාදන පසුකාලීන චක්‍රවල දී අඛණ්ඩව ප්‍රසාරණය වන අතර, විස්තාරණය කරන ලද නිශ්චිත නොවන නිෂ්පාදන ඉවත් කරයි.AFLP DNA ඇඟිලි සලකුණු වැනි ප්රාථමික සහ ඉලක්ක අච්චුව අතර සමජාතීය උපාධිය නොදන්නා ක්‍රම සඳහා අවරෝහණ PCR ප්‍රයෝජනවත් වේ.
අදාළ PCR කට්ටල
2× PCR වීරයාTMමිශ්‍ර පද්ධතියට සාමාන්‍ය PCR මිශ්‍ර පද්ධතියට වඩා PCR නිෂේධකවලට ඉහළ ඉවසීමක් ඇති අතර විවිධ සංකීර්ණ සැකිලිවල PCR විස්තාරණය සමඟ පහසුවෙන් මුහුණ දිය හැකිය.අද්විතීය ප්රතික්රියා පද්ධතිය සහ ඉහළ-කාර්යක්ෂම Taq Hero PCR ප්‍රතික්‍රියාව ඉහළ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව, විශේෂත්වය සහ සංවේදීතාව ඇති කරයි.
ඉහළ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව
එහි 3'→5' exonuclease ක්‍රියාකාරකම් නොමැතිව 5'→3' DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරකම් සහ 5'→3' exonuclease ක්‍රියාකාරකම් ඇත.
රියල් ටයිම් PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I කට්ටලය
විශේෂිත-ප්‍රශස්ත බෆරය සහ උණුසුම්-ආරම්භක ටැක් එන්සයිම විශේෂිත නොවන විස්තාරණය සහ ප්‍රයිමර් ඩිමර් සෑදීම වැළැක්විය හැකිය
ඉහළ සංවේදීතාව - සැකිල්ලේ අඩු පිටපත් හඳුනාගත හැක
මෙම කට්ටලය ප්‍රතික්‍රියාවේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සහ විශේෂත්වය ඵලදායී ලෙස වැඩිදියුණු කිරීම සඳහා අද්විතීය ප්රතික්රියා පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් සහ Foregene HotStar Taq DNA පොලිමරේස් අද්විතීය ප්රතික්රියා පද්ධතියක් සමඟ ඒකාබද්ධ කරයි.
පසු කාලය: මැයි-09-2023
