qPCR අත්හදා බැලීම් වලදී, ප්රාථමික නිර්මාණය ද ඉතා වැදගත් සබැඳියකි.ප්‍රයිමර් සුදුසුද නැද්ද යන්න, වර්ධක කාර්යක්ෂමතාව ප්‍රමිතියට ළඟා වන්නේද, වර්ධක නිෂ්පාදන විශේෂිතද, සහ පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල තිබේද යන්න සමඟ සමීපව සම්බන්ධ වේ.
ඉතින් qPCR ප්‍රයිමර් විශේෂත්වය වඩා හොඳ කරන්නේ කෙසේද?ඉහළ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව?
අද, අපි qPCR ප්‍රයිමර් එකට සැලසුම් කිරීමට ඔබව රැගෙන යන අතර, qPCR ප්‍රයිමර් නිර්මාණය අත්හදා බැලීම් වලදී කාර්යක්‍ෂම ශාස්ත්‍ර කුසලතාවක් බවට පත් කිරීමට ඉඩ හරින්න.
qPCR ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීමේදී, සාමාන්‍යයෙන් පහත කරුණු කෙරෙහි අවධානය යොමු කරන්න: ප්‍රයිමර් හැකිතාක් අභ්‍යන්තර හරහා සැලසුම් කළ යුතුය, නිෂ්පාදන දිග 100-300 bp විය යුතුය, Tm අගය 60 ° C ට හැකි තරම් ආසන්න විය යුතුය, සහ ඉහළ සහ පහළ ප්‍රයිමර් හැකි තරම් සමීප විය යුතු අතර ප්‍රයිමරයේ අවසානය G හෝ C විය යුතුය.
1. අභ්‍යන්තරය පුරා විහිදෙන ප්‍රයිමර් නිර්මාණය
qPCR ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කිරීමේදී, අභ්‍යන්තරය හරහා නිර්මාණය කර ඇති ප්‍රයිමර් තෝරාගැනීම gDNA අච්චුව විස්තාරණය වීම වැළැක්විය හැකි අතර, නිෂ්පාදන සියල්ල cDNA වර්ධකයෙන් ව්‍යුත්පන්න කර ඇති අතර එමඟින් gDNA දූෂණයේ බලපෑම ඉවත් කරයි.
2. ප්රාථමික දිග
ප්රාථමික දිග සාමාන්‍යයෙන් 18-30 nt අතර වන අතර, වර්ධක නිෂ්පාදනයේ දිග හැකිතාක් දුරට 100-300 bp අතර පාලනය කළ යුතුය.
ප්‍රාථමිකය ඉතා කෙටි නම්, එය විශේෂිත නොවන විස්තාරණයකට තුඩු දෙනු ඇත, එය ඉතා දිගු නම්, එය පහසුවෙන් ද්විතියික ව්යුහය (හිසකෙස් වල ව්යුහය වැනි) සාදනු ඇත.වර්ධක නිෂ්පාදනය ඉතා දිගු නම්, එය PCR වර්ධකයේ කාර්යක්ෂමතාවයට බලපාන පොලිමරේස් ප්රතික්රියාව සඳහා සුදුසු නොවේ.
3. GC අන්තර්ගතය සහ Tm අගය
ප්‍රයිමර් වල GC අන්තර්ගතය 40% සහ 60% අතර පාලනය කළ යුතුය.එය ඉතා ඉහළ හෝ අඩු නම්, එය ප්රතික්රියාව ආරම්භ කිරීමට හිතකර නොවේ.එකම Tm අගය සහ උෂ්නත්වය ලබා ගැනීම සඳහා ඉදිරි සහ ප්‍රතිලෝම ප්‍රයිමර් වල GC අන්තර්ගතය එකම ආසන්න විය යුතුය.
Tm අගය හැකිතාක් දුරට 55-65°C අතර විය යුතුය, සාමාන්‍යයෙන් 60°C පමණ විය යුතු අතර, උඩුගං සහ පහළ ධාරාවේ Tm අගය හැකිතාක් සමීප විය යුතුය, වඩාත් සුදුසු 4°C ට නොවැඩි විය යුතුය.
4. ප්‍රයිමරයේ 3′ අන්තයේ A තේරීමෙන් වළකින්න
ප්‍රාථමිකයේ 3′ අවසානය නොගැලපෙන විට, විවිධ පාදවල සංශ්ලේෂණ කාර්යක්ෂමතාවයේ විශාල වෙනස්කම් ඇත.අවසාන පාදය A වන විට, නොගැලපීමේදී පවා දාම සංශ්ලේෂණය ආරම්භ කළ හැකි අතර, අවසාන පාදය T විට වන විට, නොගැලපීම ප්‍රේරණයේ කාර්යක්ෂමතාව විශාල ලෙස අඩු වේ.එමනිසා, ප්‍රාථමිකයේ 3′ අවසානයේ A තේරීමෙන් වැළකී සිටීමට උත්සාහ කරන්න, T තෝරා ගැනීම වඩා හොඳය.
එය ප්‍රෝබ් ප්‍රයිමරයක් නම්, ගවේශකයේ 5′ අන්තය G විය නොහැක, මන්ද තනි G පදනමක් FAM ප්‍රතිදීප්ත වාර්තාකරු කණ්ඩායමට සම්බන්ධ කළ විට පවා, G හට FAM කාණ්ඩයෙන් නිකුත් කරන ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව නිවාදැමිය හැකි අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ව්‍යාජ ඍණාත්මක ප්‍රතිඵල ඇතිවේ.පෙනී සිටින්න.
5. මූලික බෙදා හැරීම
ප්‍රාථමිකයේ පාද හතරේ ව්‍යාප්තිය වඩාත් යෝග්‍ය වන්නේ අහඹු වන අතර, 3′ අන්තයේ 3කට වඩා G හෝ C වලට වඩා සහ අඛණ්ඩව 3කට වඩා වැළකිය යුතුය.G හෝ C GC පොහොසත් අනුක්‍රමික කලාපය තුළ යුගල කිරීම ජනනය කිරීම පහසුය.
6. ප්රාථමික සැලසුම් කලාපය සංකීර්ණ ද්විතියික ව්යුහයන් මග හැරිය යුතුය.
වර්ධක නිෂ්පාදනයේ තනි කෙඳි මගින් සාදන ලද ද්විතියික ව්යුහය PCR හි සුමට ප්රගතියට බලපානු ඇත.ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි ද්විතියික ව්යුහයක් තිබේදැයි කල්තියා පුරෝකථනය කිරීමෙන්, ප්රාථමික සැලසුම් කිරීමේදී මෙම කලාපය වළක්වා ගැනීමට උත්සාහ කරන්න.
7. ප්‍රයිමර් තමන්ම සහ ප්‍රයිමර් අතර අනුගාමී අනුපූරක පදනම් වළක්වා ගැනීමට උත්සාහ කළ යුතුය.
ප්‍රයිමරය සහ ප්‍රයිමරය අතර අඛණ්ඩ 4 පාදක අනුපූරකතාවයක් තිබිය නොහැක.ප්‍රාථමිකයටම අනුපූරක අනුපිළිවෙලක් නොතිබිය යුතුය, එසේ නොමැතිනම් එය හිසකෙස් ව්යුහයක් සෑදීමට එය නැමෙනු ඇත, එය ප්‍රයිමරයේ සහ අච්චුවේ ඇනීලිං සංයෝජනයට බලපානු ඇත.
ඉහළ සහ පහළ ප්‍රයිමර් අතර අනුපූරක අනුපිළිවෙල පැවතිය නොහැක.ප්‍රයිමර් අතර අනුපූරකතාව ප්‍රයිමර් ඩිමර් නිපදවනු ඇත, එය PCR කාර්යක්ෂමතාව අඩු කරන අතර ප්‍රමාණාත්මක නිරවද්‍යතාවයට පවා බලපායි.ප්‍රයිමර්-ඩයිමර් සහ හිසකෙස් ව්යුහය නොවැළැක්විය හැකි නම්, △G අගය ඉතා ඉහළ නොවිය යුතුය (4.5 kcal/mol ට වඩා අඩු විය යුතුය).
8. ප්‍රාථමිකයන් ඉලක්කගත නිශ්චිත නිෂ්පාදනය විස්තාරණය කරයි.
qPCR හඳුනාගැනීමේ අවසාන ඉලක්කය වන්නේ ඉලක්කගත ජානයේ බහුලත්වය අවබෝධ කර ගැනීමයි.නිශ්චිත නොවන විස්තාරණයක් සිදුවුවහොත්, ප්‍රමාණනය සාවද්‍ය වනු ඇත.එබැවින්, ප්‍රාථමිකයන් නිර්මාණය කිරීමෙන් පසුව, ඒවා BLAST මගින් පරීක්ෂා කළ යුතු අතර, නිෂ්පාදනවල විශේෂත්වය අනුක්‍රමික දත්ත ගබඩාවේ සංසන්දනය කෙරේ.
මීළඟට, අපි qPCR ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කිරීම සඳහා උදාහරණයක් ලෙස මානව GAS6 (Growth arrest specific 6) ජානය ගනිමු.
01 විමසුම් ජානය
හෝමෝ GAS6NCBI හරහා.මෙහිදී, ජාන නාමය සහ විශේෂයන් අනුකූල බව සහතික කිරීම සඳහා සංසන්දනය කිරීම කෙරෙහි අවධානය යොමු කළ යුතුය.
02 ජාන අනුපිළිවෙල සොයන්න
(1) ඉලක්ක අනුක්‍රමය ප්‍රවේණික DNA නම්, ජානයේ ප්‍රවේණික DNA අනුක්‍රමය වන පළමු එක තෝරන්න.
(2) ඉලක්ක අනුපිළිවෙල mRNA නම්, දෙවන එක තෝරන්න.ඇතුල් වූ පසු, පහත වගුවේ "CDS" ක්ලික් කරන්න.දුඹුරු පසුබිම් අනුපිළිවෙල ජානයේ කේතීකරණ අනුපිළිවෙලයි.
03 ඩිසයින් ප්‍රයිමර්
Primer-BLAST අතුරුමුහුණත ඇතුල් කරන්න
ඉහළ වම් පස ඇති Fasta ආකෘතියෙන් ජාන අනුක්‍රමය අංකය හෝ අනුපිළිවෙල ඇතුළත් කරන්න, සහ අදාළ පරාමිතීන් පුරවන්න.
“ප්‍රයිමර් ලබා ගන්න” ක්ලික් කරන්න, එවිට එවැනි පරාමිති තේරීම වෙනත් බෙදීමේ ප්‍රභේදවලට විස්තාරණය කරන බව ඔබට පැවසීමට NCBI උත්පතන වනු ඇත.අපට විවිධ බෙදීම් ප්‍රභේද පරීක්ෂා කර සුදුසු ප්‍රයිමර් යුගලයක් ලබා ගැනීමට ඒවා ඉදිරිපත් කළ හැකිය (පහත රූපයේ දැක්වෙන පරිදි).මෙම ක්‍රියාවලිය ක්‍රියාත්මක වීමට තත්පර දස ගණනක් ගත විය හැක.
මෙම ප්‍රයිමර් යුගලවල ඇනීලිං උෂ්ණත්වය 60°C පමණ වේ.අත්හදා බැලීමේ අරමුණ අනුව, අත්හදා බැලීම සඳහා ප්රාථමික වල මධ්‍යස්ථ දිග, හොඳ නිශ්චිතභාවය සහ අඩු ස්වයං-අනුපූරකයක් සහිත ප්‍රයිමර් තෝරන්න, සහ සාර්ථක අනුපාතය තරමක් ඉහළ ය!
04Primer Specificity verification
ඇත්ත වශයෙන්ම, ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීමට අමතරව, ප්‍රයිමර්-බ්ලාස්ට් හට අප විසින්ම නිර්මාණය කරන ලද ප්‍රයිමර් ඇගයීමටද හැකිය.ප්‍රයිමර් සැලසුම් පිටුවට ආපසු යන්න, අප විසින් නිර්මාණය කරන ලද උඩුගං සහ පහළ ප්‍රයිමර් ඇතුළත් කරන්න, සහ අනෙකුත් පරාමිති සකස් නොකෙරේ.ඉදිරිපත් කිරීමෙන් පසු, ප්‍රයිමර් යුගලය වෙනත් ජානවලද පවතින්නේ දැයි ඔබට දැක ගත හැකිය.ඒවා සියල්ලම අපට විස්තාරණය කිරීමට අවශ්‍ය ජානය මත ප්‍රදර්ශනය වන්නේ නම්, මෙම ප්‍රයිමර් යුගලයේ විශේෂත්වය විශිෂ්ට බව පෙන්නුම් කරයි!(උදාහරණයක් ලෙස, ප්‍රයිමර් විමසුමේ එකම ප්‍රතිඵලය මෙයයි!)
05 ප්රාථමික තත්ත්ව විනිශ්චය
"සම්පූර්ණ වර්ධක කාර්යක්ෂමතාවය සම්මතය දක්වා", "වර්ධක නිෂ්පාදන ලක්ෂණ" සහ "විශ්වසනීය පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල" ඒකාබද්ධ කරන "පරිපූර්ණ" ප්‍රාථමිකය කුමන ආකාරයේ ප්‍රාථමිකයක් ද?
විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව
දියවන වක්රය
ප්‍රයිමර් වල විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 90%-110% දක්වා ළඟා වේ, එයින් අදහස් කරන්නේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව හොඳ බවත්, ද්‍රවාංක වක්රය තනි උච්චයක් සහ සාමාන්‍යයෙන් Tm>80 ° C වන බවත්, එයින් අදහස් වන්නේ විස්තාරණ විශේෂත්වය හොඳ බවයි.
ආශ්රිත නිෂ්පාදන:
රියල් ටයිම් PCR පහසුයි - SYBR GREEN I
රියල් ටයිම් PCR Easy-Taqman
පසු කාලය: පෙබරවාරි-10-2023
