RT-qPCR යනු අණුක ජීව විද්‍යාවේ මූලික අත්හදා බැලීම වන අතර සෑම කෙනෙකුම එය හුරුපුරුදු විය යුතුය.එයට ප්‍රධාන වශයෙන් පියවර තුනක් ඇතුළත් වේ: RNA නිස්සාරණය, cDNA වෙත ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR.එය උදව් කරන්නේ නැත, සිදුවන්නේ කුමක්ද?සමඟ ගැටලුවක් ඇති බව පෙනෙන්නට තිබේප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ අත්හදා බැලීම!ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පරීක්ෂණයට අවශ්‍ය වන්නේ RNA, dNTP, ප්‍රයිමර් සහප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමකේන්ද්රාපසාරී නලයට සහ හොඳින් මිශ්ර, නමුත් සැබෑ මෙහෙයුම් ක්රියාවලියේදී, තවමත් අවධානය යොමු කළ යුතු බොහෝ තොරතුරු තිබේ.අපි ඒ ගැන ඉගෙන ගනිමු!

RNA වල ගුණාත්මක භාවය විනිශ්චය කරන්නේ කෙසේද?
cDNA ලබා ගැනීම සඳහා, RNA වල ගුණාත්මකභාවය ඉතා වැදගත් වේ!ප්‍රධාන වශයෙන් අංශ දෙකකින් RNA ගුණාත්මක බව හඳුනාගත හැක.
(1) RNA අඛණ්ඩතාව:RNA අඛණ්ඩතාව ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් තහවුරු කළ හැක. යුකැරියෝට උදාහරණයක් ලෙස ගත් විට, සම්පූර්ණ සම්පූර්ණ RNA හට පැහැදිලි කලාප තුනක් ඇත, විශාල සිට කුඩා දක්වා අණුක බර 28S, 18S සහ 5S වන අතර 28S 18S මෙන් දෙගුණයක් දීප්තිමත් වේ;පටි තුනක් දැකිය හැකි නම්, නමුත් කලාප වර්ගය බොඳ වී හෝ විසරණය යනු RNA අර්ධ වශයෙන් පිරිහී ඇති බවයි.මෙම අවස්ථාවේදී, කරුණාකර ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාව වහාම සිදු කර අච්චු ආදානය සුදුසු ලෙස වැඩි කරන්න;කුඩා අණුක බරක් හෝ පටියක් නොමැති පටියක් පමණක් දැකිය හැකි නම්, RNA සම්පූර්ණයෙන්ම ක්ෂය වී ඇති අතර නැවත නිස්සාරණය කිරීම අවශ්‍ය වේ.Agilent 2100 උපරිම රූප සටහන සහ RIN අගය සමඟ RNA හි අඛණ්ඩතාව පෙන්නුම් කරයි.නියුක්ලෙයික් අම්ලය නොවෙනස්ව පවතී නම්, ඉලෙක්ට්‍රෝෆෙරෝග්‍රෑම් හි මූලික රේඛාව සමතලා වේ;න්යෂ්ටික අම්ලය දැඩි ලෙස දිරාපත් වී ඇත්නම්, මූලික රේඛාව අසමාන වන අතර වඩාත් පිරිහීමේ මුදුන් දිස්වේ;RIN හි අගය 0-10 පරාසය තුළ RNA හි අඛණ්ඩතාව පිළිබිඹු කරයි, අගය විශාල වන තරමට RNA වල ගුණාත්මක භාවය වඩා හොඳය.හොඳයි, සම්පූර්ණත්වයේ මට්ටම ඉහළයි.
(2) RNA හි සංශුද්ධතාවය:OD260/280 අනුපාතය UV වර්ණාවලීක්ෂය මගින් හඳුනාගත හැක.OD260/280 අනුපාතය 1.9 සහ 2.1 අතර නම්, සංශුද්ධතාවය ඉතා හොඳයි.
අවශේෂ ප්‍රවේණික DNA සාවද්‍ය ප්‍රමාණාත්මක ප්‍රතිඵලවලට හේතු විය හැක
RNA නිස්සාරණය කළ විට, අපට ලැබෙන RNA පිරිසිදු නොකළ ජානමය DNA (gDNA) සමඟ මිශ්‍ර විය හැක.එබැවින්, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමෙන් පසු cDNA ද මිශ්‍ර වේgDNA.පහළ ධාරාව අතරතුරqPCRප්රතික්රියාව,cDNAසහ gDNA එකවර විස්තාරණය කළ හැකි අතර, සාපේක්ෂ වශයෙන් කුඩා CT අගයක් ඇති කරයි, එබැවින් ප්රතිඵල පක්ෂග්රාහී විය හැකිය.
ඉතින් මේ තත්ත්වය තුළ අප කළ යුත්තේ කුමක්ද?පෙරනිමිතියෝජනා කරයි:
(1) RNA නිස්සාරණයේදී තීරු නිස්සාරණයෙන් ඉවත් කළ හැකි ප්‍රතිලෝම RNA මත ජෙනෝම පිරිසිදු කිරීම සිදු කරන්න;
(2) නිස්සාරණය කරන ලද RNA DNase සමඟ සලකන්නI , නමුත් එය EDTA සමඟ අවසන් කරන්න;
ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකජෙනෝම නිෂ්කාශන මොඩියුල සමඟ;

ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා ප්‍රයිමර් තෝරා ගන්නේ කෙසේද?
ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රයිමර් ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාවේ ප්‍රතිඵලයට ද බලපායි.අත්හදා බැලීමේ විශේෂිත තත්වයන් අනුව ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා ඔබට අහඹු ප්‍රයිමර්, ඔලිගෝ ඩීටී හෝ ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර් තෝරා ගත හැකිය:
(1) විශේෂිත පිටපත්: ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර් නිර්දේශ කරනු ලැබේ;
(2) දිගු කොටස් පිටපත්: Oligo dT/gene-specific primers නිර්දේශ කෙරේ;
(3) දිගු ඛණ්ඩ පිටපත්වල අභ්‍යන්තර කොටස්: ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර්/ සසම්භාවී ප්‍රයිමර් / සසම්භාවී ප්‍රයිමර් + ඔලිගෝ ඩීටී.පසුව සිදු කරන ලද qPCR අත්හදා බැලීම සිදු කරන්නේ නම්, Oligo dT තනියම භාවිතා කළ නොහැක, මන්ද Oligo dT භාවිතා කිරීමෙන් පමණක් 3′ අවසාන පක්ෂග්‍රාහීත්වය ඇති විය හැකි අතර, එය සාවද්‍ය qPCR පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලවලට මග පාදයි;
(4) miRNA: Stem-loop primers හෝ tailing primers භාවිතා කළ හැක.

ප්‍රමාණකරණය සඳහා ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ නිෂ්පාදන cDNA කොපමණ වාර ගණනක් තනුක කළ යුතුද?
ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ නිෂ්පාදනයේ cDNA ලබා ගැනීමෙන් පසුව, qPCR අත්හදා බැලීම් සඳහා cDNA කොපමණ වාර ගණනක් තනුක කළ යුතුද යන්න ඉතා වැදගත් වේ.cDNA සාන්ද්‍රණය ඉතා ඉහළ හෝ ඉතා අඩු නම්, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයට බලපෑම් ඇති විය හැක.cDNA සාන්ද්‍රණය මැනිය හැකිද, එය කළ යුත්තේ කෙසේද?
;මෙම අවස්ථාවේදී, සමහර මිතුරන් පවසනු ඇත, එවිට මම පිරිසිදු කිරීමෙන් පසු සාන්ද්රණය මනිමි;මෙහිදී, CDNA පවිත්‍ර කිරීම නිර්දේශ නොකරන බව Foregene මතක් කිරීමට කැමතියි, මන්ද ප්‍රතිවර්තනය මගින් ලබා ගන්නා cDNA හි දිග වෙනස් වන අතර, කෙටි cDNA පිරිසිදු කිරීමේදී නැති වී යනු ඇත.
(2) ඉතින් කුමක් කළ යුතුද?qPCR පරීක්ෂණයට පෙර, cDNA හි තනුක අනුක්‍රමණය පූර්ව අත්හදා බැලීම හරහා තීරණය කළ හැකිය.උදාහරණයක් ලෙස: cDNA කොටස් ද්‍රාවණය, 10 ගුණයකින් තනුක කිරීම සහ 100 ගුණයකින් තනුක කිරීම qPCR අත්හදා බැලීම් සඳහා සැකිලි ලෙස භාවිතා කරන්න, සහ 18-28 පරාසයේ CT අගයක් සහිත තනුක සාධකය තෝරන්න.

miRNAs ප්‍රතිලෝම පිටපත් කළ යුත්තේ කෙසේද?
miRNA යනු ප්‍රෝටීන සඳහා කේත නොකරන 22 nt පමණ විශාලත්වයකින් යුත් තනි කෙඳි සහිත කුඩා RNA අණුවකි.එහි කෙටි දිග නිසා, සාම්ප්‍රදායික qPCR ක්‍රමයට එය සෘජුව ප්‍රමාණ කිරීමට අපහසු බැවින්, බොහෝ විට miRNA දිගු කිරීම අවශ්‍ය වේ;miRNA සඳහා බහුලව භාවිතා වන ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්‍රම අතරට stem-loop ක්‍රමය සහ tailing method ඇතුළත් වේ.
කඳ-ලූප් ක්‍රමය නම් කඳ-ලූප් ප්‍රයිමර් එකතු කිරීමෙන් miRNA දිගු කිරීමයි.මෙම හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමයට වැඩි සංවේදීතාවයක් සහ විශේෂත්වයක් ඇත, නමුත් හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිදානය අඩුය.එක් ප්‍රතිලෝම පිටපතකට හඳුනාගත හැක්කේ එක් miRNA සහ අභ්‍යන්තර යොමුවක් පමණි;වලිගය එකතු කිරීමේ ක්‍රමය දෙකකින් සමන්විත වේ, එය PolyA පොලිමරේස් සහ ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් යන එන්සයිම දෙකක ඒකාබද්ධ ක්‍රියාවකින් සම්පූර්ණ වේ.PolyA polymerase එහි දිග වැඩි කිරීම සඳහා miRNA වෙත PolyA වලිග එකතු කිරීම සඳහා වගකිව යුතු අතර ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාව සිදු කරයි.මෙම ක්‍රමයට ඉහළ හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිදානයක් ඇති අතර එක් ප්‍රතිලෝම පිටපතක බහු miRNA සහ අභ්‍යන්තර යොමු හඳුනා ගත හැක, නමුත් කඳ-ලූප් ක්‍රමයේ සංවේදීතාව සහ විශේෂත්වය අඩුය.