හඳුනාගැනීමේ විශේෂත්වය

බොහෝ අවස්ථාවන්හීදී, ප්‍රාථමික නිර්මාණයේ අරමුණ වන්නේ PCR හි විශේෂත්වය උපරිම කිරීමයි.මෙය තීරණය වන්නේ බොහෝ විචල්‍යයන්ගේ අඩු වැඩි වශයෙන් පුරෝකථනය කළ හැකි බලපෑම මගිනි.එක් වැදගත් විචල්‍යයක් වන්නේ ප්‍රාථමිකයේ 3′අන්තයේ ඇති අනුපිළිවෙලයි.

වැදගත් ලෙස, නිශ්චිතභාවය සඳහා නිර්මාණය කර ඇති PCR විශ්ලේෂණ පුළුල් ගතික පරාසයක් තුළ ඉහළ කාර්යක්ෂමතාවයක් පවත්වා ගැනීමට වැඩි ඉඩක් ඇත, මන්ද විශ්ලේෂණය විශේෂිත නොවන විස්තාරණ නිෂ්පාදන නිෂ්පාදනය නොකරන අතර එමඟින් PCR ප්‍රතික්‍රියාකාරක සමඟ තරඟ කිරීම හෝ ප්‍රධාන විස්තාරණ ප්‍රතික්‍රියාව වළක්වයි.

ඇත්ත වශයෙන්ම, සමහර අවස්ථාවලදී, නිශ්චිතභාවය වඩාත්ම වැදගත් නොවේ, උදාහරණයක් ලෙස, ඉලක්කය සමීපව සම්බන්ධ වූ නමුත් විවිධ ව්යාධිජනකයන් ගණනය කිරීම, විශේෂ සැලසුම්, ප්රශස්තකරණය සහ සත්යාපන ප්රමිතීන් අවශ්ය වේ.

ද්රවාංක වක්රය යනු ඇම්ප්ලිකන් වල විශේෂත්වය තක්සේරු කිරීම සඳහා සම්මත ක්රමයකි, අවම වශයෙන් තනි ඉලක්කයක් විස්තාරණය කළ යුතුද යන්න සම්බන්ධයෙන්.කෙසේ වෙතත්, දියවන වක්‍ර නොමඟ යවන සුළු විය හැකි බව අවධාරණය කළ යුතුය, මන්ද, උදාහරණයක් ලෙස, උපප්‍රශස්ත ප්‍රයිමර් සහ අඩු සැකිලි සාන්ද්‍රණයන්හි ඒකාබද්ධ බලපෑම් මගින් ඒවාට බලපෑම් කළ හැකිය.

P5 |දියවන වක්‍රය මඟින් ඉලක්කගත DNA දෙකක විවිධ ප්‍රමාණවලින් හඳුනාගැනීම් දෙකකින් ලබාගත් Tm මාරුවීම් පෙන්වයි.

A. වැඩි සාන්ද්‍රණයකදී (දැන්වීම්)), qPCR මැනීම අවසන් වූ පසු පැහැදිලි ප්‍රයිමර් ඩිමර් නොමැත.අච්චු සාන්ද්‍රණය පිටපත් 50 (e) දක්වා අඩු වන විට, විශේෂිත නොවන නිෂ්පාදනයක් දිස් වීමට පටන් ගන්නා අතර අඩුම සාන්ද්‍රණයේ (f) එකම නිෂ්පාදනය බවට පත්වේ.

B. පරීක්‍ෂණයේදී සියලුම ඉලක්ක සාන්ද්‍රණයන්හි එකම Tms වාර්තා වූ අතර, අවම සාන්ද්‍රණයේදී (පිටපත් 5ක්) පවා පැහැදිලි ප්‍රයිමර් ඩයිමර් නොමැත.මෙම හඳුනාගැනීමේ ක්‍රම දෙක භාවිතා කරන විට, NTCs තුළ විස්තාරණ නිෂ්පාදන කිසිවක් අනාවරණය නොවීය.

P5 මඟින් සැකිල්ල විවිධ සාන්ද්‍රණයන්හි පවතින සාම්පල සමඟ ලබාගත් ද්‍රාවණ වක්‍ර පෙන්වයි.P 5a පෙන්නුම් කරන්නේ අඩුම සාන්ද්‍රණයන් දෙකේදී, නිපදවන විශේෂිත නොවන විස්තාරණ නිෂ්පාදනවල Tms නිශ්චිත ඇම්ප්ලිකන් වලට වඩා අඩු බවයි.

පැහැදිලිවම, අඩු සාන්ද්‍රණයක පවතින ඉලක්ක හඳුනා ගැනීමට මෙම හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමය විශ්වාසදායක ලෙස භාවිතා කළ නොහැක.

සිත්ගන්නා කරුණ නම්, NTCs, එනම්, DNA කිසිවක් නොමැති සාම්පල, (නිශ්චිත නොවන) වර්ධක නිෂ්පාදන වාර්තා නොකළ අතර, පසුබිම් ජානමය DNA විශේෂිත නොවන විස්තාරණය/බහුඅවෛරීකරණයට සහභාගී විය හැකි බව පෙන්නුම් කරයි.

සමහර විට එවැනි පසුබිම් ප්‍රාථමික සහ විශේෂිත නොවන විස්තාරණයට පිළියම් යෙදිය නොහැක, නමුත් බොහෝ විට ඕනෑම සැකිලි සාන්ද්‍රණයක සහ NTC (P 5b) තුළ විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක් නොමැති හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමයක් සැලසුම් කිරීමට හැකි වේ.

මෙහිදී, Cq 35කින් ඉලක්කගත සාන්ද්‍රණයේ විස්තාරණය වාර්තා කිරීම පවා නිශ්චිත විසර්ජන වක්‍රයක් නිපදවයි.ඒ හා සමානව, NTCs විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක කිසිදු සලකුනක් නොපෙන්වයි.සමහර විට, හඳුනාගැනීමේ හැසිරීම මව් මත්පැන් මත රඳා පැවතිය හැකි අතර, විවිධ Mg2+ සාන්ද්‍රණයන්ට සම්බන්ධ ඇතැම් බෆර සංයුතිවල විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක් පමණක් අනාවරණය වේ.

හඳුනාගැනීමේ ස්ථාවරත්වය

Ta හි ප්‍රශස්තකරණය qPCR හඳුනාගැනීමේ ආනුභවික සත්‍යාපනය සහ ප්‍රශස්ත කිරීමේ ක්‍රියාවලියේ ප්‍රයෝජනවත් පියවරකි.එය NTC වර්ධකයකින් තොරව අඩුම Cq නිපදවන උෂ්ණත්වය (හෝ උෂ්ණත්ව පරාසය) පෙන්වීමෙන් ප්‍රාථමික කට්ටලයේ ශක්තිමත් බව පිළිබඳ සෘජු ඇඟවීමක් සපයයි.

ඉහළ mRNA ප්‍රකාශනයක් ඇති පුද්ගලයින් සඳහා සංවේදීතාවයේ දෙකේ සිට හතර ගුණයක වෙනස වැදගත් නොවනු ඇත, නමුත් රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණ සඳහා, එය ධනාත්මක සහ ව්‍යාජ ඍණාත්මක ප්‍රතිඵල අතර වෙනස අදහස් විය හැක.

qPCR ප්‍රයිමර් වල Ta ගුණාංග බොහෝ සෙයින් වෙනස් විය හැක.සමහර පරීක්ෂණ ඉතා ශක්තිමත් නොවන අතර, ඒවා ප්‍රාථමිකයේ ප්‍රශස්ත Ta අගය යටතේ සිදු නොකළහොත්, ඒවා ඉක්මනින් කඩා වැටෙනු ඇත.

මෙය වැදගත් වන්නේ සැබෑ ලෝකයේ මෙවැනි හඳුනාගැනීම් බොහෝ විට ගැටළු සහගත වන අතර නියැදියේ සංශුද්ධතාවය, DNA සාන්ද්‍රණය හෝ වෙනත් DNA තිබීම ප්‍රශස්ත නොවිය හැකි බැවිනි.

ඊට අමතරව, ඉලක්කගත පිටපත් අංකය පුළුල් පරාසයකින් වෙනස් විය හැකි අතර, ප්‍රතික්‍රියාකාරක, ප්ලාස්ටික් උපකරණ හෝ උපකරණ පරීක්ෂණය සැකසීමේදී භාවිතා කරන ඒවාට වඩා වෙනස් විය හැකිය.

P6|උෂ්ණත්ව අනුක්‍රමය PCR හඳුනාගැනීමේ විවිධ ශක්තිමත් බව පෙන්වයි.

A. මිනිස් මොළයේ RNA වලින් සකස් කරන ලද cDNA මත PCR සිදු කිරීමට Bioline's Sensifast SYBR mastermix (නාමාවලිය අංක BIO-98050) භාවිතා කරන්න.

B. ඇපලීන්හි විස්තාරණ සිතියම සහ විසර්ජන වක්‍රය වාර්තා කිරීමට Bio-Rad හි CFX qPCR උපකරණය භාවිතා කරන්න (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG) හි විස්තාරණ ප්‍රස්තාරය සහ දියවන වක්‍රය.

D. GFAP හි විස්තාරණ ප්‍රස්තාරය සහ විසර්ජන වක්‍රය (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. 7C උෂ්ණත්ව අනුක්‍රමයක් යටතේ වාර්තා කරන ලද Cq හි වෙනස පෙන්නුම් කරමින් විවිධ නිර්වින්දන උෂ්ණත්වවලදී වාර්තා කරන ලද Cqs.

P 6 මගින් අනවශ්‍ය පරීක්‍ෂණයක සාමාන්‍ය ප්‍රතිඵලයක් පෙන්වයි, එහිදී qPCR 59C සහ 67C (P 6a) අතර Tas අනුක්‍රමයක් භාවිතයෙන් සිදු කරන ලද අතර, මිනිස් මොළයට විශේෂිත වූ ජාන තුනක් සඳහා ප්‍රයිමර් භාවිතා කරයි.

ඔපලින් ප්‍රයිමර් පරමාදර්ශී නොවන බව විස්තාරණ ප්‍රස්ථාරයෙන් දැක ගත හැක, මන්ද ඒවායේ ප්‍රශස්ත Ta පරාසය ඉතා පටුය (රූපය 6b), එනම්, Cqs බහුලව විසිරී ඇති අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස Cqs ඒවායේ ප්‍රශස්ත Cqs අඩු අගයට සැලකිය යුතු ලෙස සංසන්දනය වේ.

මෙම හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමය අස්ථායී වන අතර උපප්‍රශස්ත විස්තාරණයට හේතු විය හැක.එමනිසා, මෙම ප්‍රයිමර් යුගලය ප්‍රතිනිර්මාණය කළ යුතුය.මීට අමතරව, දියවන වක්‍ර විශ්ලේෂණය (ඇතුළත් කිරීම) පෙන්නුම් කරන්නේ මෙම හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමයේ විශේෂත්වය ද ගැටළු සහගත විය හැකි බවයි, මන්ද එක් එක් Ta වල දියවන වක්‍රය වෙනස් වේ.

P 6c හි පෙන්වා ඇති ACSBG1 හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමය ඉහත Opalin හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමයට වඩා ශක්තිමත් ය, නමුත් එය තවමත් පරමාදර්ශයෙන් බොහෝ දුරස් වන අතර, එය වැඩිදියුණු කළ හැකි බව පෙනෙන්නට තිබේ.

කෙසේ වෙතත්, මෙම හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමය මඟින් නිපදවන ද්‍රාව්‍ය වක්‍රය සියලු Tas (inset) හි එකම උපරිම අගය පෙන්නුම් කරන බැවින්, ශක්තිමත් බව සහ නිශ්චිතභාවය අතර අවශ්‍ය සම්බන්ධයක් නොමැති බව අපි අවධාරණය කරමු.

අනෙක් අතට, P 6d හි පෙන්වා ඇති GFAP පරීක්ෂණයේ දී මෙන්, ශක්තිමත්තා පරීක්ෂණය වඩාත් ඉවසිලිවන්ත වන අතර, Tas හි පුළුල් පරාසයක සමාන Cqs නිපදවයි.

එම සෙල්සියස් අංශක 8 පරාසය තුළ ලබාගත් Cqs හි වෙනස 1 ට වඩා අඩු වන අතර, ද්රාවණ වක්රය (inset) මෙම උෂ්ණත්ව පරාසය තුළ හඳුනාගැනීමේ ලක්ෂණ තහවුරු කරයි.ගණනය කළ Tas සහ සැබෑ Ta පරාසය බෙහෙවින් වෙනස් විය හැකි බව සඳහන් කිරීම වටී.

පර්යේෂකයන්ට කාර්යක්ෂම ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කිරීමට උපකාර කිරීම සඳහා නිර්මාණය කර ඇති බොහෝ මාර්ගෝපදේශ ඇත, ඒවායින් බොහොමයක් දිගුකාලීනව ස්ථාපිත නීති මත පදනම් වන අතර ප්‍රයිමර් වල 3′අවසානය කෙරෙහි වැඩි අවධානයක් යොමු කර ඇත.බොහෝ විට 3' අන්තයේ G හෝ C සහ G හෝ C පාද දෙකක් (GC clamp) ඇතුළත් කිරීම නිර්දේශ කරනු ලැබේ, නමුත් අවසාන පාද 5න් දෙකකට වඩා වැඩි නොවේ.

ප්රායෝගිකව, මෙම නීතිරීති පර්යේෂකයන්ට මඟ පෙන්විය හැකි නමුත්, සියලු තත්වයන් යටතේ ඒවා අනිවාර්යයෙන්ම නිවැරදි නොවේ.

P7 |ප්‍රාථමිකයේ 3′අන්තය විශේෂත්වය හෝ කාර්යක්ෂමතාවය කෙරෙහි අඩු බලපෑමක් ඇති කරයි.

A. මානව HIF-1α (NM_181054.2) ජානය සඳහා ප්‍රාථමික වල පිහිටීම.

B. පරීක්ෂණ අයිතම හයක් විස්තාරණය කිරීමට Agilent Brilliant III SYBR හරිත මව් මත්පැන් (Cat. No. 600882) භාවිතා කරන්න.

C. Bio-Rad හි CFX qPCR උපකරණය සහ 3′end ප්‍රයිමර් මගින් පටිගත කරන ලද විස්තාරණ ප්‍රස්තාරය සහ දියවන වක්‍රය.NTCs රතු පැහැයෙන් දැක්වේ.

D. එක් එක් පරීක්ෂණ අයිතමයේ Cqs වාර්තාව

උදාහරණයක් ලෙස, P 7 හි ප්‍රතිඵලය 3′අන්ත රීතියට පටහැනි වේ.NTC හි නිශ්චිත නොවන විස්තාරණයකට තුඩු දෙන ප්‍රයිමර් සංයෝජන දෙකක් සමඟින් සියලුම සැලසුම් මූලික වශයෙන් එකම ප්‍රතිඵල නිපදවයි.

කෙසේ වෙතත්, අපට GC ක්ලිප් එකේ බලපෑමට සහය දැක්විය නොහැක, මන්ද මෙම අවස්ථාවෙහිදී, A හෝ T පාදක උපරිම 30 ක් ලෙස භාවිතා කිරීම නිශ්චිතභාවය අඩු නොකරයි.

GGCC හි F ප්‍රයිමරය අවසන් වන ටෙස්ට් C, NTC වල Cqs වාර්තා කර ඇති අතර, කෙනෙකුට 30-අවසානයේ මෙම අනුක්‍රම වළක්වා ගැනීමට අවශ්‍ය විය හැකි බව පෙන්නුම් කරයි.ප්‍රයිමර් යුගලයක හොඳම 3′අන්ත අනුක්‍රමය තීරණය කිරීමට ඇති එකම ක්‍රමය සමහර අපේක්ෂක ප්‍රයිමර් පර්යේෂණාත්මකව ඇගයීම බව අපි අවධාරණය කරමු.

විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව

වැදගත් වන්නේ, විශේෂිත නොවන PCR හඳුනාගැනීම කිසි විටෙක නිශ්චිත විය නොහැකි වුවද, එන්සයිම, මව් මත්පැන්, ආකලන සහ බයිසිකල් තත්ත්‍වයන් වෙනස් කිරීමෙන් විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව විවිධ ආකාරවලින් සකස් කර උපරිම කළ හැක.

PCR හඳුනාගැනීමේ කාර්යක්ෂමතාවය තක්සේරු කිරීම සඳහා, ඉලක්කගත න්යෂ්ටික අම්ලය මෙන් 10 හෝ 5 ගුණයක අනුක්රමික තනුක කිරීම, එනම් "සම්මත වක්ර ක්රමය" භාවිතා කිරීම වඩාත් සුදුසුය.

සම්මත වක්‍රයක් ජනනය කිරීම සඳහා PCR ඇම්ප්ලිකන් හෝ කෘතිම DNA ඉලක්ක භාවිතා කරන්නේ නම්, මෙම ඉලක්කවල අනුක්‍රමික තනුක පසුබිම් DNA (ප්‍රවේණික DNA වැනි) නියත ප්‍රමාණයක් සමඟ මිශ්‍ර කළ යුතුය.

P8 |PCR හි කාර්යක්ෂමතාව තක්සේරු කිරීම සඳහා තනුක වක්‍රය.

A. PCR සහ දියවන වක්‍ර තත්ත්වයන් සඳහා HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA සහ R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC සහ Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (නාමාවලිය අංක 600882) සඳහා ප්‍රාථමික භාවිත කරන්න.

B. 100 ng RNA ප්‍රතිලෝම පිටපත් කර, 2 වරක් තනුක කරන ලද අතර, අනුක්‍රමිකව තනුක කරන ලද cDNA සාම්පල 5 වතාවක් 1 ng මානව ජානමය DNA වෙත තනුක කරන ලදී.ද්‍රවාංක වක්‍රය ඇතුල් කිරීමෙහි දැක්වේ.

C. දෙවන cDNA නියැදිය සඳහා RT ප්‍රතික්‍රියාව, තනුක කිරීම සහ අනුක්‍රමික තනුක කිරීම නැවත නැවතත් කරන ලද අතර ප්‍රතිඵල සමාන විය.

P 8 සම්මත වක්‍ර දෙකක් පෙන්වයි, වෙනස් cDNA සාම්පල දෙකක එකම හඳුනාගැනීමේ ක්‍රමය භාවිතා කරමින්, ප්‍රති result ලය එකම කාර්යක්ෂමතාව, 100% ක් පමණ වන අතර, R2 අගය ද සමාන වේ, එනම්, පර්යේෂණාත්මක දත්ත සහ ප්‍රතිගාමී රේඛාව හෝ දත්ත රේඛීය උපාධිය අතර ගැළපෙන මට්ටම.

සම්මත වක්‍ර දෙක සැසඳිය හැකි නමුත් හරියටම සමාන නොවේ.ඉලක්කය නිවැරදිව ප්‍රමාණනය කිරීම අරමුණ නම්, අවිනිශ්චිතතාවය පැහැදිලි නොකර පිටපත් අංකයක් ගණනය කිරීම පිළිගත නොහැකි බව සටහන් කළ යුතුය.

P9 |සම්මත වක්‍රයක් භාවිතයෙන් ප්‍රමාණකරණය හා සම්බන්ධ මිනුම් අවිනිශ්චිතතාවය.

A. PCR සහ දියවන වක්‍ර තත්ත්වයන් සිදු කිරීමට GAPDH (NM_002046) සඳහා ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන්න.F: ACAGTTGCCATGTAGACC සහ R: TAACTGGTTGAGCACAGG සහ Bioline's Sensifast SYBR mastermix (නාමාවලිය අංක BIO-98050).

B. Bio-Rad's CFX qPCR උපකරණය සමඟ පටිගත කරන ලද විස්තාරණ ප්‍රස්ථාරය, දියවන වක්‍රය සහ සම්මත වක්‍රය.

C. සම්මත වක්‍ර ප්‍රස්ථාරය සහ 95% විශ්වාස අන්තරය (CI).

D. තනුක වක්‍රයෙන් ලබාගත් Cq අගයන් තුනේ පිටපත් අංකය සහ 95% විශ්වාස අන්තරය.

P 9 පෙන්නුම් කරන්නේ ප්‍රශස්ත පරීක්ෂණයක් සඳහා, තනි සම්මත වක්‍රයක ආවේණික විචල්‍යතාවය ආසන්න වශයෙන් 2 ගුණයක් (95% විශ්වාසනීය පරතරය, අවම සිට උපරිමය) වන අතර එය අපේක්ෂා කළ හැකි කුඩාම විචල්‍යතාවය විය හැකිය.

අදාළ නිෂ්පාදනය:

සෛල සෘජු RT qPCR කට්ටලය

Mouse Tail සෘජු PCR කට්ටලය

සත්ව පටක සෘජු PCR කට්ටලය