සෛල සෘජු RT qPCR කට්ටලය—SYBR GREEN I සෘජු සෛල ලයිසිස් සෛලය සූදානම් එක්-පියවර qRT-PCR කට්ටල
විස්තර
මෙම කට්ටලය RT-qPCR ප්‍රතික්‍රියා සඳහා සංස්කෘත සෛල සාම්පල වලින් RNA ඉක්මනින් මුදා හැරිය හැකි අද්විතීය ලයිසිස් බෆර පද්ධතියක් භාවිතා කරයි, එමඟින් කාලය ගතවන සහ වෙහෙසකාරී RNA පිරිසිදු කිරීමේ ක්‍රියාවලිය ඉවත් කරයි.RNA අච්චුව විනාඩි 7කින් ලබා ගත හැක.5×සෘජු RT මිශ්රණය සහ 2×කට්ටලය මඟින් සපයන සෘජු qPCR මිශ්රණය-SYBR ප්රතික්රියාකාරක මඟින් තත්‍ය කාලීන ප්‍රමාණාත්මක PCR ප්‍රතිඵල ඉක්මනින් හා ඵලදායී ලෙස ලබා ගත හැක.
5×සෘජු RT මිශ්රණය සහ 2×සෘජු qPCR මිශ්රණය-SYBR සතුව ප්‍රබල නිෂේධක ඉවසීමක් ඇති අතර, සාම්පලවල ලයිසේට් සෘජුවම RT-qPCR සඳහා අච්චුව ලෙස භාවිතා කළ හැක.මෙම කට්ටලය තුළ අද්විතීය RNA අධි-සම්බන්ධතා Foregene ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ Hot D-Taq DNA පොලිමරේස්, dNTPs, MgCl අඩංගු වේ.2, ප්‍රතික්‍රියා බෆරය, PCR ප්‍රශස්තකරණය සහ ස්ථායීකාරකය.
පිරිවිතර
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
කට්ටල සංරචක
| I කොටස | බෆර් CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| බෆර් ST | |
| II කොටස | DNA මකනය |
| 5× සෘජු RT මිශ්රණය | |
| 2× සෘජු qPCR මිශ්රණය-SYBR | |
| 50× ROX යොමු ඩයි | |
| RNase-නිදහස් ddH2O | |
| උපදෙස් | |
විශේෂාංග සහ වාසි
■සරල සහ ඵලදායී : Cell Direct RT තාක්ෂණය සමඟින්, RNA සාම්පල විනාඩි 7කින් ලබා ගත හැක.
■ නියැදි ඉල්ලුම කුඩා වන අතර, සෛල 10ක් තරම් අඩු ප්‍රමාණයක් පරීක්ෂා කළ හැක.
■ ඉහළ ප්‍රතිදානය: එය 384, 96, 24, 12, 6-ළිං තහඩු තුළ වගා කරන ලද සෛල තුළ RNA ඉක්මනින් හඳුනාගත හැකිය.
■ DNA මකනයට ඉක්මනින් මුදා හරින ලද ජෙනෝම ඉවත් කළ හැකි අතර, පසුකාලීන පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල මත ඇති වන බලපෑම බෙහෙවින් අඩු කරයි.
■ ප්‍රශස්ත RT සහ qPCR පද්ධතිය මඟින් පියවර දෙකේ RT-PCR ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම වඩාත් කාර්යක්ෂම සහ PCR වඩාත් නිශ්චිත වන අතර RT-qPCR ප්‍රතික්‍රියා නිෂේධකවලට වඩා ප්‍රතිරෝධී කරයි.
කට්ටල යෙදුම
යෙදුමේ විෂය පථය: සංස්කෘතික සෛල.
- සාම්පල ලිසිස් මගින් නිකුත් කරන ලද RNA: මෙම කට්ටලයේ RT-qPCR අච්චුවට පමණක් අදාළ වේ.
- කට්ටලය පහත සඳහන් අරමුණු සඳහා භාවිතා කළ හැක: ජාන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය, siRNA-මැදිහත් වූ ජාන නිශ්ශබ්ද කිරීමේ බලපෑම තහවුරු කිරීම, මත්ද්‍රව්‍ය පරීක්ෂා කිරීම යනාදිය.
රූප සටහන
ගබඩා කිරීම සහ කල් තබා ගැනීම
මෙම කට්ටලයේ I කොටස 4℃ හි ගබඩා කළ යුතුය;II කොටස -20℃ ගබඩා කළ යුතුය.
Foregene Protease Plus II 4 හි ගබඩා කළ යුතුය℃, -20℃ හි කැටි නොකරන්න.
ප්රතික්රියාකාරක 2×සෘජු qPCR මිශ්රණය-SYBR -20 හි ගබඩා කළ යුතුය℃අඳුරේ;නිතර භාවිතා කරන්නේ නම්, එය 4 හි ගබඩා කළ හැකියකෙටි කාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා ℃ (දින 10ක් ඇතුළත භාවිතා කරන්න).
රියල් ටයිම් PCR ප්‍රයිමර් සැලසුම් මූලධර්ම
Forward Primer සහ Reverse Primer
රියල් ටයිම් PCR සඳහා, ප්‍රාථමික නිර්මාණය ඉතා වැදගත් වේ.ප්‍රයිමර් PCR විස්තාරණයේ විශේෂත්වය සහ කාර්යක්ෂමතාවයට සම්බන්ධ වන අතර පහත සඳහන් මූලධර්මවලට අදාළව නිර්මාණය කළ හැක:
ප්‍රාථමික දිග: 18-30bp.
GC අන්තර්ගතය: 40-60%.
Tm අගය: Primer 5 වැනි ප්‍රයිමර් නිර්මාණ මෘදුකාංග, ප්‍රාථමිකයේ Tm අගය ලබා දිය හැක.ඉහළ සහ පහළ ප්‍රාථමික වල Tm අගයන් හැකි තරම් සමීප විය යුතුය.Tm ගණනය කිරීමේ සූත්‍රය ද භාවිතා කළ හැක: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR සිදු කරන විට, ප්‍රාථමික Tm අගය 5 °C ට වඩා අඩු උෂ්ණත්වයක් සාමාන්‍යයෙන් annealing උෂ්ණත්වය ලෙස තෝරා ගනු ලැබේ (නිවාරණ උෂ්ණත්වයේ අනුරූප වැඩි වීම PCR ප්‍රතික්‍රියාවේ විශේෂත්වය වැඩි කළ හැක).
ප්‍රයිමර් සහ PCR නිෂ්පාදන:
සැලසුම් ප්‍රයිමර් PCR විස්තාරණ නිෂ්පාදන දිග වඩාත් සුදුසු වන්නේ 100-150bp වේ.
සැකිල්ලේ ද්විතියික ව්‍යුහාත්මක ප්‍රදේශයේ සැලසුම් ප්‍රයිමර් හැකිතාක් දුරට වැළැක්විය යුතුය.
ඉහළ සහ පහළ ප්‍රයිමර් වල 3′ අන්ත අතර අනුපූරක පාද 2ක් හෝ වැඩි ගණනක් සෑදීමෙන් වළකින්න.
ප්‍රයිමර් 3′ පර්යන්ත පාදය අතිරේක අනුගාමී G හෝ C 3ක් සමඟ පැවතිය නොහැක.
ප්‍රයිමර් වලට අනුපූරක ව්‍යුහයන් තිබිය නොහැක, එසේ නොමැතිනම් හිසකෙස් ව්‍යුහයක් සාදනු ඇත, එය PCR විස්තාරණයට බලපායි.
ATCG ප්‍රාථමික අනුපිළිවෙලෙහි හැකිතාක් ඒකාකාරව බෙදා හැරිය යුතු අතර, 3′ පර්යන්ත පදනම T ලෙස වැළැක්විය යුතුය.
උපග්රන්ථය 1: සෛල සෘජු RT-qPCR කට්ටල සංරචක අතිරේක ඇසුරුම
1.සෛල ලයිසිස් විසඳුම
|
| |||
| කට්ටල සංරචක (24-ළිං ලයිසිස් පද්ධතිය / ළිඳ) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| ටී 100 | ටී 500 | ||
| කොටසමම | බෆර් CL | 20 මිලි | මිලි ලීටර් 100 යි |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| බෆර් ST | 1 ml × 2 | 10 මිලි | |
| කොටසII | DNA මකනය | 400 μl | 1 ml × 2 |
2.RT මිශ්රණය
|
| |
| කට්ටල සංරචක (20 μl ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය) | DRT-01011-B1 |
| ටී 200 | |
| 5× සෘජු RT මිශ්රණය | 800 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml × 2 |
|
| ||
| කට්ටල සංරචක (20 μl ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| ටී 200 | ටී 1000 | |
| 2× සෘජු qPCR මිශ්රණය-SYBR | 1 ml × 2 | 1.7 ml × 6 |
| 50× ROX යොමු ඩයි | 40 μl | 200 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 මිලි | 10 මිලි |
උපදෙස් අත්පොත්:
