RT-qPCR පරීක්ෂණයට RNA නිස්සාරණය සහ තත්ත්ව තක්සේරුව, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ qPCR පියවර තුනක් ඇතුළත් වේ, සෑම පියවරකටම පූර්වාරක්ෂාවන් රාශියක් ඇත, අපි පහත විස්තරාත්මකව හඳුන්වා දෙන්නෙමු.
Ⅰ.RNA තත්ත්ව තක්සේරුව
RT-qPCR අත්හදා බැලීමේ දී, RNA නිස්සාරණය අවසන් වූ පසු, RNA වල ගුණාත්මක භාවය ඇගයීමට ලක් කළ යුතු අතර, පසු විපරම් පරීක්ෂණය සිදු කළ හැක්කේ එය සුදුසුකම් ලැබීමෙන් පසුව පමණි.ඇගයීම් ක්රම අතරට වර්ණාවලීක්ෂ මානය, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 විශ්ලේෂණය ඇතුළත් වේ, ඒ අතර බහුලව භාවිතා වන වර්ණාවලීක්ෂ දර්ශක සහ agarose gel electrophoresis ක්‍රමය හඳුනාගැනීම.ආර්එන්ඒ සාන්ද්‍රණය, සංශුද්ධතාවය සහ අඛණ්ඩතාව හඳුනා ගැනීම සහ විශ්ලේෂණය සම්පූර්ණ කිරීම සඳහා මෙම ක්රම දෙක එකට භාවිතා කළ යුතු අතර එමඟින් ආර්එන්ඒ වල ගුණාත්මකභාවය සහතික කළ යුතු බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය.
අදාළ RNA හුදකලා කට්ටලය:
සෛල සම්පූර්ණ RNA හුදකලා කට්ටලය
මිනිත්තු 11 කින් විවිධ සංස්කෘත සෛල වලින් ඉතා පිරිසිදු හා උසස් තත්ත්වයේ සම්පූර්ණ RNA ලබා ගත හැක.
විවිධ සත්ව පටක වලින් ඉහළ සංශුද්ධතාවය සහ උසස් තත්වයේ සම්පූර්ණ RNA ඉක්මනින් හා කාර්යක්ෂමව නිස්සාරණය කරන්න.
වර්ණාවලි ඡායාරූපමානය:
වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාමාපකය ප්‍රධාන වශයෙන් RNA හි සාන්ද්‍රණය සහ සංශුද්ධතාවය තීරණය කිරීමට භාවිතා කරයි, නමුත් එයට RNA වල අඛණ්ඩතාව සහ ජානමය අපද්‍රව්‍ය හඳුනා ගත නොහැක.ඒවා අතර, A260/280 සහ A260/230 RNA සංශුද්ධතාවය හඳුනා ගැනීම සඳහා වැදගත් පරාමිති වන අතර, ඒවායේ අගයන්හි උච්චාවචනය අනුව RNA සංශුද්ධතාවය හඳුනාගත හැකිය:
1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA සංශුද්ධතාවය යහපත් බව පෙන්නුම් කරයි;A260/280<1.9, RNA හි ප්‍රෝටීන් අපද්‍රව්‍ය තිබිය හැකි බව පෙන්නුම් කරයි;A260/280>2.1, RNA හි විය හැකි අර්ධ පරිහානිය පෙන්නුම් කරයි, එය agarose gel electrophoresis මගින් තවදුරටත් තහවුරු කළ හැක.
2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA සංශුද්ධතාවය යහපත් බව පෙන්නුම් කරයි;A260/230< 2.0, RNA වල ෆීනෝල්, එතනෝල් හෝ සීනි වැනි කාබනික ප්‍රතික්‍රියාකාරකවල අපද්‍රව්‍ය තිබිය හැකි බව පෙන්නුම් කරයි.
ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස්:
Agarose gel electrophoresis විශ්ලේෂණයට RNA අඛණ්ඩතාව, ජෙනෝමය සහ ප්‍රෝටීන් අපද්‍රව්‍ය විශ්ලේෂණය කළ හැකි නමුත්, RNA සාන්ද්‍රණය නිවැරදිව ගණනය කිරීමට හෝ කාබනික ප්‍රතික්‍රියාකාරකවල අපද්‍රව්‍ය හඳුනා ගැනීමට නොහැකිය.උදාහරණයක් ලෙස යුකැරියෝටික් RNA සැකිලි ගන්න:
1. ආර්එන්ඒ ඇගරෝස් ජෙල් විද්යුත් විච්ඡේදනයට ලක් විය.ජෙල් සිතියමේ තිබුණේ 28sRNA, 18sRNA සහ 5.8sRNA වල තනි කලාප තුනක් පමණක් නම්, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ නිස්සාරණය කරන ලද RNA නොවෙනස්ව පවතින බවයි.ඇදගෙන යාමේ සංසිද්ධියක් තිබේ නම්, එය RNA හි අර්ධ වශයෙන් පිරිහීම පෙන්නුම් කරයි.
2. මැලියම් කුහරය සහ 28sRNA කලාපය අතර තනි දීප්තිමත් කලාපයක් තිබේ නම්, ජානමය DNA අවශේෂ තිබිය හැක.
3. මැලියම් කුහරය තුළ පටි දිස්වන්නේ නම්, එය ප්‍රෝටීන් සහ අනෙකුත් සාර්ව අණුක ද්‍රව්‍යවල අපද්‍රව්‍ය තිබිය හැකි බව පෙන්නුම් කරයි.
Ⅱ. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම
RNA නිස්සාරණය අවසන් වූ පසු, එය පසුකාලීන අත්හදා බැලීම් සඳහා cDNA බවට ප්‍රතිවර්තනය කිරීම අවශ්ය වේ, එබැවින් ආපසු හැරවීමේ පියවර අත්‍යවශ්‍ය වේ.ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් සහ ප්‍රයිමර් තේරීමෙන් ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම හඳුන්වා දෙනු ලැබේ:
ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම තේරීම:
සාමාන්‍ය ප්‍රතිලෝම පිටපත්වලට AMV RTase සහ MMLV RTase ඇතුළත් වේ.AMV RTase හි RNase H හි ප්‍රබල ක්‍රියාකාරකම්, කෙටි සංශ්ලේෂණ දිග, අඩු සංශ්ලේෂණ ප්‍රමාණය සහ හොඳ තාප ස්ථායීතාවය (42 ~ 55℃) ඇත.MMLV RTase හි RNase H ක්‍රියාකාරිත්වය දුර්වලයි, සංශ්ලේෂණ දිග දිගු වේ, සංශ්ලේෂණ ප්‍රමාණය ඉහළයි, සහ තාප ස්ථායීතාවය දුර්වලයි (37 ~ 42℃).
RNase H එන්සයිමයට RNA අච්චුව පිරිහීමේ කාර්යය ඇති බැවින්, දුර්වල RNase H ක්‍රියාකාරකම් සහිත MMLV ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේදී මනාප ලෙස තෝරා ගත යුතු අතර, පසුව ජාන ඉංජිනේරු විද්‍යාවෙන් පසුව, MMLV හි තාප ස්ථායීතාවය ගුණාත්මක පිම්මකට පැමිණ ඇත.Foregene ගැනීමForeasy Reverse Transcriptase (ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා M-MLV) උදාහරණයක් ලෙස, එය ජාන ප්‍රතිසංයෝජන තාක්‍ෂණය භාවිතයෙන් E. coli ඉංජිනේරුමය බැක්ටීරියා වල ප්‍රකාශිත නව ප්‍රතිලෝම පිටපතකි.එය තනි කෙඳි සහිත RNA, DNA හෝ RNA:DNA දෙමුහුන් වලින් අනුපූරක DNA පොටක් සංස්ලේෂණය කරන ප්‍රතිසංයෝජන DNA පොලිමරේස් වේ.එයට RNase H ක්‍රියාකාරකම්, ශක්තිමත් ස්ථායීතාවයක්, ශක්තිමත් RNA සම්බන්ධයක් සහ ඉහළ හඳුනාගැනීමේ සංවේදීතාවයක් නොමැත.
Foreasy Reverse Transcriptase (ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා M-MLV)
ප්‍රාථමික තේරීම:
සාමාන්‍යයෙන් RT ප්‍රයිමර් වර්ග තුනකට වැටේ: ඔලිගෝ ඩීටී, සසම්භාවී ප්‍රයිමර් සහ ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර්.විවිධ පර්යේෂණාත්මක අවශ්‍යතා අනුව භාවිතය සඳහා සුදුසු ප්‍රයිමර් තෝරන්න.
1. සැකිල්ල යුකැරියෝටික් සම්භවයක් නම් සහ ප්‍රමාද වූ cDNA සාමාන්‍ය PCR විස්තාරණය සඳහා භාවිතා කරන්නේ නම්, Oligo (dT) නිර්දේශ කරනු ලැබේ;පසුකාලීන අත්හදා බැලීම qPCR සඳහා පමණක් භාවිතා කරන්නේ නම්, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා ඔලිගෝ (dT) අහඹු ප්‍රයිමර් සමඟ මිශ්ර කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.
2. අච්චුව ප්‍රොකරියෝට් වලින් නම්, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා සසම්භාවී ප්‍රයිමර් හෝ ජාන විශේෂිත ප්‍රයිමර් තෝරාගත යුතුය.
Ⅲ.qPCR
ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණකරණය ප්‍රධාන වශයෙන් ප්රමාණාත්මක ක්රම තෝරා ගැනීම, ප්‍රාථමික සැලසුම් මූලධර්ම, ROX තේරීම, ප්රතික්රියා පද්ධති වින්‍යාසය සහ ප්රතික්රියා තත්ව සැකසීම යනාදිය මගින් විස්තාරණය කර ඇත.
ප්රමාණාත්මක ක්රම තෝරා ගැනීම:
ප්රමාණාත්මක ක්රම සාපේක්ෂ ප්රමාණාත්මක ක්රම සහ නිරපේක්ෂ ප්රමාණාත්මක ක්රම ලෙස බෙදා ඇත.ජාන ප්‍රකාශනයට ඇතැම් ප්‍රතිකාර ක්‍රමවල බලපෑම හඳුනා ගැනීමට, විවිධ කාලවලදී ජාන ප්‍රකාශනයේ වෙනස හඳුනා ගැනීමට සහ විවිධ පටකවල ජාන ප්‍රකාශනයේ වෙනස සංසන්දනය කිරීමට සාපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණය භාවිතා කළ හැකිය.නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණය මඟින් වෛරසයේ ඇති න්‍යෂ්ටික අම්ල ප්‍රමාණය සහ යනාදිය හඳුනාගත හැකිය.අත්හදා බැලීම් කරන විට, අපගේම අත්හදා බැලීම් අනුව සුදුසු ප්රමාණාත්මක ක්රම තෝරාගත යුතුය.
ප්‍රාථමික සැලසුම් මූලධර්ම:
qPCR සඳහා ප්‍රාථමිකයේ සැලසුම විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සහ නිෂ්පාදන විශේෂත්වය සමඟ කෙලින්ම සම්බන්ධ වේ.එබැවින්, හොඳ ප්‍රයිමර් නිවැරදිව සැලසුම් කිරීම සාර්ථක qPCR හි පළමු පියවරයි.ප්‍රාථමික සැලසුම් කිරීමේදී, සාම්ප්‍රදායික ප්‍රයිමර් සැලසුමේ මූලධර්මය සපුරාලන විට පහත සඳහන් මූලධර්ම කෙරෙහි අවධානය යොමු කළ යුතුය:
1. ඉලක්ක ඛණ්ඩයේ දිග 100 සහ 300 bp අතර පාලනය වේ;
2. ජානමය DNA වල බලපෑම වළක්වා ගැනීම සඳහා Cross-exon නිර්මාණය;
3. සැලසුම් කරන ලද ප්‍රාථමිකයන් විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සඳහා පරීක්ෂා කළ යුතු අතර, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව ප්‍රමිතියට (90-110%) ළඟා වූ විට පමණක් ඒවා ප්රමාණාත්මක පරීක්ෂණ සඳහා භාවිතා කළ හැකිය;
4. ප්‍රාථමික සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් 0.1uM සහ 1.0uM අතර ප්‍රශස්ත වේ.
තෝරා ගැනීමROX:
ප්රමාණාත්මක ප්‍රතික්‍රියාවේ ක්‍රියාවලියේදී, ROX හට ප්‍රතිඵලවල පුනරාවර්තන හැකියාව වැඩි දියුණු කරමින්, වාෂ්පීකරණය සහ ඝනීභවනය නිසා ඇති වන දෘශ්‍ය මාර්ග වෙනස, නල දෝෂය හෝ පරිමාව වෙනස ඒකාකාරව සකස් කළ හැක.කෙසේ වෙතත්, ROX තෝරාගැනීම උපකරණයට සම්බන්ධ බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය.qPCR උපකරණයට සිදුරු අතර වෙනස ස්වයංක්‍රීයව නිවැරදි කිරීමේ කාර්යය තිබේ නම්, එය ROX එකතු කිරීමට අවශ්ය නොවේ;එසේ නොමැති නම්, එය ROX නිවැරදි කිරීම එක් කිරීමට අවශ්ය වේ.ප්‍රතික්‍රියාකාරක මිලදී ගැනීමේ කුඩා හවුල්කරුවන් නිවැරදි ROX තෝරා ගැනීමට භාවිතා කරන උපකරණයට අනුව විය යුතුය, පසුකාලීන වැරදි වළක්වා ගන්න.
ප්රතික්රියා පද්ධතිය සකස් කිරීම:
20ul සහ 50ul ප්රතික්රියා පරිමාව වඩාත් සුදුසුය.පද්ධතිය සකස් කිරීමේදී පහත සඳහන් කරුණු කෙරෙහි අවධානය යොමු කළ යුතුය:
1. ප්රතික්රියා පද්ධතිය අතිශය පිරිසිදු වැඩ බංකුවේ වාතාශ්‍රය මගින් සකස් කළ යුතුය, නව ddH2O එක් එක් අත්හදා බැලීම සඳහා භාවිතා වේ;
2. සෑම අත්හදා බැලීමක් සඳහාම පද්ධතියේ දූෂණයක් තිබේද යන්න තහවුරු කිරීම සඳහා NTC සකස් කිරීමට අවශ්ය වන අතර, පද්ධතිය සකස් කිරීමේදී සෑම ප්‍රයිමර් යුගලයක්ම NTC කළ යුතුය;
3. RNA සැකිල්ලේ gDNA අවශේෂ තිබේ දැයි හඳුනා ගැනීමට, හඳුනා ගැනීම සඳහා එක් එක් නියැදිය සඳහා NRT සකස් කළ හැක;
4. පද්ධතිය සකස් කරන විට, එක් සාම්පලයක් සඳහා අවම වශයෙන් තාක්ෂණික පුනරාවර්තන 3 ක් සිදු කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ;
5. අච්චුව cDNA වන විට, qPCR අත්හදා බැලීමේදී ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ පද්ධතියේ නිෂේධන බලපෑම අඩු කිරීම සඳහා 5-10 වාරයක් තනුක කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.CT අගය 20-30 අතර පහත වැටෙන පරිදි, අනුක්‍රමය අනුව සැකිලි ප්‍රමාණය ගවේෂණය කිරීම වඩා හොඳය;
6. අවශ්ය ප්රතික්රියා සංඛ්යාව තීරණය කිරීම, ප්රතික්රියා ගණන අනුව 5-10% කින් වැඩි කිරීම සහ පරිමාව වින්යාස අංකය ගණනය කිරීම;
7, පද්ධතිය පූර්ව මිශ්ර මූලධර්මය භාවිතයෙන් සකස් කර ඇත, කේන්ද්රාපසාරී කිරීමෙන් පසු මිශ්ර කිරීම සහ බුබුලු නොමැති බව සහතික කිරීම;
8, හැකිතාක් දුරට ආධාරක පරිභෝජන ද්‍රව්‍ය තෝරා ගැනීමට.
අදාළ RT-qPCR කට්ටලය
මෙම කට්ටලය ප්‍රතික්‍රියාවේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සහ විශේෂත්වය ඵලදායී ලෙස වැඩිදියුණු කිරීම සඳහා අද්විතීය ප්රතික්රියා පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් සහ Foregene HotStar Taq DNA පොලිමරේස් අද්විතීය ප්රතික්රියා පද්ධතියක් සමඟ ඒකාබද්ධ කරයි.
පසු කාලය: අප්රේල්-23-2023
