මධ්‍යම ප්‍රවාදයේ RNA යනු DNA සහ ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනය අතර පිටපත් කිරීමේ මැදිහත්කරු බව කවුරුත් දන්නා කරුණකි.DNA හඳුනාගැනීම හා සසඳන විට, RNA හඳුනාගැනීම මගින් ජීවීන්ගේ ජාන ප්‍රකාශනය වඩාත් වෛෂයිකව පිළිබිඹු කළ හැක.RNA සම්බන්ධ අත්හදා බැලීම්වලට ඇතුළත් වන්නේ: qRT-PCR, RNA-Seq, සහ විලයන ජාන හඳුනාගැනීම යනාදිය. RNA වලම ලක්ෂණ මත පදනම්ව (RNA වල සීනි වලල්ල DNA වල සීනි වළල්ලට වඩා නිදහස් හයිඩ්‍රොක්සයිල් කාණ්ඩයක් ඇත), පරිසරයේ RNases විශාල සංඛ්‍යාවක් සමඟින්, RNA DNA වලට වඩා අස්ථායී සහ දිරාපත් වීමට පහසුය.කසළ ඇතුලට, කුණු පිටතට, RNA වල ගුණාත්මක භාවය හොඳ නැතිනම්, පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල අසතුටුදායක විය යුතුය, නිශ්චිතවම සාවද්‍ය දත්ත හෝ දුර්වල පුනරාවර්තන බව ලෙස ප්‍රකාශ විය යුතුය.එබැවින්, RNA සැකසීම කෙරෙහි වැඩි අවධානයක් යොමු කළ යුතු අතර, පසුකාලීන පර්යේෂණාත්මක දත්තවල නිරවද්‍යතාවය සහ නිරවද්‍යතාවය සහතික කිරීම සඳහා තත්ත්ව පාලනයේ සබැඳිය ද වඩාත් වැදගත් වේ.

RNA වල තත්ත්ව පාලනය සඳහා, පහත සඳහන් බහුලව භාවිතා වන ක්‍රම තිබේ:

• වර්ණාවලීක්ෂය
• ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස්
• කඩිසර ජෛව විශ්ලේෂකය
• තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR
• Qubit fluorescent ඩයි ක්‍රමය

01 වර්ණාවලි ඡායාරූපමිතිය

RNA ද්විත්ව බන්ධන සංයුති කර ඇති අතර 260nm තරංග ආයාමයකින් අවශෝෂණ උච්චස්ථානයක් ඇත.Lambert-Beer ගේ නියමයට අනුව, අපට 260nm හි අවශෝෂණ උච්චයේ සිට RNA සාන්ද්‍රණය ගණනය කළ හැකිය.මීට අමතරව, අපට 260nm, 280nm සහ 230nm අවශෝෂණ උච්ච අනුපාතය අනුව RNA හි සංශුද්ධතාවය ගණනය කළ හැකිය.280nm සහ 230nm යනු පිළිවෙලින් ප්‍රෝටීන සහ කුඩා අණු වල අවශෝෂණ උච්ච වේ.සුදුසුකම් ලත් RNA සංශුද්ධතාවයේ A260/A280 සහ A260/A230 අනුපාතය 2 ට වඩා වැඩි විය යුතුය. එය 2 ට වඩා අඩු නම්, එයින් අදහස් වන්නේ RNA සාම්පලයේ ප්‍රෝටීන් හෝ කුඩා අණු දූෂණයක් ඇති බවත් එය නැවත පිරිසිදු කළ යුතු බවත්ය.අපවිත්‍ර වීමේ ප්‍රභවයන්, PCR ප්‍රතික්‍රියා වල වර්ධක කාර්යක්ෂමතාව නිෂේධනය කිරීම වැනි, සාවද්‍ය ප්‍රමාණාත්මක ප්‍රතිඵල ඇති කිරීම වැනි, පහළ ප්‍රවාහයේ අත්හදා බැලීම් වලට බලපානු ඇත.RNA හි සංශුද්ධතාවය පසුකාලීන ප්‍රතිඵල කෙරෙහි විශාල බලපෑමක් ඇති කරයි, එබැවින් වර්ණාවලීක්ෂ ප්‍රභාමිතිය සාමාන්‍යයෙන් න්‍යෂ්ටික අම්ල අත්හදා බැලීම්වල පළමු පියවරේදී අත්‍යවශ්‍ය තත්ත්ව පාලන සම්බන්ධකයකි.

රූපය 1. සාමාන්‍ය RNA/DNA අවශෝෂණ වර්ණාවලිය

02 ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස්

සංශුද්ධතාවයට අමතරව, RNA හි අඛණ්ඩතාව ද RNA වල ගුණාත්මක භාවය විනිශ්චය කිරීම සඳහා වැදගත් දර්ශකවලින් එකකි.ආර්එන්ඒ ක්ෂය වීම නියැදියේ කෙටි කොටස් විශාල සංඛ්‍යාවක් ඇති කිරීමට හේතු වනු ඇත, එබැවින් ඵලදායි ලෙස හඳුනා ගත හැකි සහ විමර්ශන අනුපිළිවෙලින් ආවරණය කළ හැකි RNA කොටස් සංඛ්‍යාව අඩු වේ.1% ඇගරෝස් ජෙල් මත සම්පූර්ණ RNA වල ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් මගින් RNA අඛණ්ඩතාව පරීක්ෂා කළ හැක.මෙම ක්‍රමයට ජෙල් ඔබම වින්‍යාසගත කළ හැක, නැතහොත් අඛණ්ඩතාව පරීක්ෂා කිරීම සඳහා පෙර සැකසූ E-Gel™ පද්ධතිය භාවිතා කරන්න.මුළු RNA වලින් 80%කට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් ribosomal RNA වේ, එයින් බහුතරයක් 28S සහ 18S rRNA වලින් සමන්විත වේ (ක්ෂීරපායි පද්ධතිවල).හොඳ තත්ත්වයේ RNA පැහැදිලි දීප්තිමත් තීරු දෙකක් පෙන්වනු ඇත, ඒවා පිළිවෙලින් 5 Kb සහ 2 Kb දී 28S සහ 18S දීප්තිමත් තීරු වන අතර අනුපාතය 2:1 ට ආසන්න වේ.එය විසරණ තත්වයක තිබේ නම්, එයින් අදහස් වන්නේ RNA සාම්පලය දිරාපත් වී ඇති බවයි, RNA වල ගුණාත්මක භාවය තවදුරටත් පරීක්ෂා කිරීම සඳහා පසුව විස්තර කරන ලද ක්‍රමය භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.

රූපය 2. ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මත දිරාපත් වූ (ලේන් 2) සහ නොවෙනස්ව පවතින ආර්එන්ඒ (මංතීරු 3) සංසන්දනය

03 Agilent Bioanalyzer

ඉහත විස්තර කර ඇති ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරෙසිස් ක්‍රමයට අමතරව, RNA හි අඛණ්ඩතාව සරලව හා ඉක්මනින් හඳුනා ගැනීමට අපට උපකාර කළ හැකි අතර, අපට RNA හි අඛණ්ඩතාව තීරණය කිරීම සඳහා Agilent bioanalyzer භාවිතා කළ හැකිය.එය RNA සාන්ද්‍රණය සහ අඛණ්ඩතාව තක්සේරු කිරීම සඳහා ක්ෂුද්‍ර තරල, කේශනාලිකා විද්‍යුත් විච්ඡේදනය සහ ප්‍රතිදීප්ත සංයෝගයක් භාවිතා කරයි.RNA සාම්පලයේ පැතිකඩ විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා ගොඩනඟන ලද ඇල්ගොරිතම භාවිතා කිරීමෙන්, Agilent bioanalyzer හට යොමු RNA අඛණ්ඩතා අගයක්, RNA අඛණ්ඩතා අංකයක් (මෙතැන් සිට RIN ලෙස හැඳින්වේ) [1] ගණනය කළ හැක.RIN හි අගය විශාල වන තරමට RNA හි අඛණ්ඩතාව වැඩි වේ (1 අතිශයින් පිරිහී ඇත, 10 වඩාත්ම සම්පූර්ණ වේ).RNA සම්බන්ධ සමහර අත්හදා බැලීම් තත්ත්ව තක්සේරුව සඳහා පරාමිතියක් ලෙස RIN භාවිතා කිරීමට යෝජනා කරයි.උදාහරණයක් ලෙස ඉහළ කාර්යක්‍ෂම අනුක්‍රමික අත්හදා බැලීම් (මෙතැන් සිට NGS ලෙස හැඳින්වේ) ගෙන, Thermo Fisher's Oncomine පැනල් ශ්‍රේණියේ B සෛල සහ T සෛල ප්‍රතිදේහජනක ප්‍රතිග්‍රාහක හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කරන Oncomine™ Human Immune Repertoire හි මාර්ගෝපදේශ, RIN අගයන් සහිත සාම්පල 4 ට වඩා වැඩි ඵලදායි අගයන් මැනිය හැකි බව යෝජනා කරයි.විවිධ පැනල සඳහා විවිධ නිර්දේශිත පරාසයන් ඇති අතර, බොහෝ විට ඉහළ RIN එකකට වඩා ඵලදායී දත්ත ගෙන ඒමට හැකිය.

Figure 3, Oncomine™ Human Immune Repertoire පරීක්‍ෂණවලදී, RIN 4ට වඩා වැඩි සාම්පලවලට වඩා ඵලදායී කියවීම් සහ T සෛල ක්ලෝන හඳුනා ගත හැක.【2】

කෙසේ වෙතත්, RIN අගය ද යම් සීමාවන් ඇත.RIN NGS පර්යේෂණාත්මක දත්තවල ගුණාත්මක භාවය සමඟ ඉහළ සහසම්බන්ධයක් ඇතත්, එය FFPE සාම්පල සඳහා සුදුසු නොවේ.FFPE සාම්පල දිගු කාලයක් රසායනිකව ප්‍රතිකාර කර ඇති අතර, නිස්සාරණය කරන ලද RNA සාමාන්‍යයෙන් සාපේක්ෂව අඩු RIN අගයක් ඇත.කෙසේ වෙතත්, අත්හදා බැලීමේ ඵලදායී දත්ත අසතුටුදායක විය යුතු බව මින් අදහස් නොවේ.FFPE සාම්පලවල ගුණාත්මකභාවය නිවැරදිව තක්සේරු කිරීම සඳහා, අපි RIN හැර වෙනත් මිනුම් භාවිතා කළ යුතුය.RIN වලට අමතරව, Agilent bioanalyzer හට RNA ගුණාත්මක භාවයේ ඇගයීම් පරාමිතියක් ලෙස DV200 අගය ගණනය කළ හැක.DV200 යනු RNA සාම්පලයක 200 bp ට වඩා විශාල කොටස්වල අනුපාතය ගණනය කරන පරාමිතියකි.DV200 යනු RIN ට වඩා FFPE නියැදි ගුණාත්මක භාවය පිළිබඳ හොඳ දර්ශකයකි.FFPE විසින් නිස්සාරණය කරන ලද RNA සඳහා, එය ඵලදායි ලෙස හඳුනාගත හැකි ජාන සංඛ්‍යාව සහ ජානවල විවිධත්වය සමඟ ඉතා ඉහළ සහසම්බන්ධයක් ඇත [3].DV200 හට FFPE හි තත්ත්ව හඳුනාගැනීමේ අඩුපාඩු පිරිමැසිය හැකි වුවද, Agilent bioanalyzer හට සාම්පලවල නිෂේධක තිබේද යන්න ඇතුළුව RNA සාම්පලවල ගුණාත්මක ගැටලු පුළුල් ලෙස විශ්ලේෂණය කිරීමට තවමත් නොහැක.නිෂේධකයන් විසින්ම පහළ ප්‍රවාහයේ අත්හදා බැලීම්වල විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයට බලපෑම් කළ හැකි අතර ප්‍රයෝජනවත් දත්ත ප්‍රමාණය අඩු කරයි.නියැදියේ නිෂේධනයක් තිබේදැයි දැන ගැනීමට, අපට ඊළඟ විස්තර කර ඇති තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR ක්‍රමය අනුගමනය කළ හැකිය.

04 තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR

තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR ක්‍රමයට නියැදියේ ඇති නිෂේධක හඳුනා ගැනීමට පමණක් නොව, FFPE නියැදියේ RNA වල ගුණාත්මක භාවය නිවැරදිව පිළිබිඹු කළ හැක.Agilent ජීව විද්‍යාත්මක විශ්ලේෂක සමඟ සසඳන විට, තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක උපකරණ ප්‍රධාන ජීව විද්‍යාගාරවල ඒවායේ පුළුල් භාවිතය හේතුවෙන් වඩාත් ජනප්‍රිය වේ.RNA සාම්පලවල ගුණාත්මකභාවය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපට අවශ්‍ය වන්නේ GUSB (Cat no. Hs00939627) වැනි අභ්‍යන්තර විමර්ශන ජාන සඳහා ප්‍රාථමික පරීක්ෂණ මිලදී ගැනීම හෝ සකස් කිරීම පමණි.නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණාත්මක අත්හදා බැලීම් සිදු කිරීම සඳහා මෙම ප්‍රාථමික, පරීක්ෂණ සහ ප්‍රමිති (දන්නා සාන්ද්‍රණයේ සම්පූර්ණ RNA) භාවිතා කිරීමෙන්, ඵලදායි RNA කොටස් සාන්ද්‍රණය RNA ගුණාත්මක භාවයේ ඇගයීම් ප්‍රමිතිය ලෙස ගණනය කළ හැකිය (Functional RNA Quantitation (FRQ) කෙටියෙන්).NGS පරීක්ෂණයකදී, RNA සාම්පලවල FRQ ඵලදායී දත්ත පරිමාව සමඟ ඉතා ඉහළ සහසම්බන්ධයක් ඇති බව අපට පෙනී ගියේය.0.2ng/uL FRQ ට වඩා වැඩි සියලුම සාම්පල සඳහා, කියවීම් වලින් අවම වශයෙන් 70% ට යොමු අනුපිළිවෙල ඵලදායී ලෙස ආවරණය කළ හැක (රූපය 4).

රූප සටහන 4, ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක ක්‍රමය මගින් අනාවරණය කරගත් FRQ අගය NGS අත්හදා බැලීමේදී ලබාගත් ඵලදායී දත්ත සමඟ ඉතා ඉහළ සහසම්බන්ධයක් (R2>0.9) ඇත.රතු රේඛාව යනු FRQ අගය 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) ට සමාන වේ.【4】

FFPE සාම්පල සඳහා අදාළ වීමට අමතරව, තත්‍ය කාලීන ප්‍රමාණාත්මක PCR ක්‍රමයට සාම්පලවල නිෂේධක ඵලදායී ලෙස නිරීක්ෂණය කළ හැක.අභ්‍යන්තර ධනාත්මක පාලනය (IPC) සහ එහි විශ්ලේෂණය සමඟ ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියට අනාවරණය කර ගත යුතු නියැදිය අපට එක් කළ හැකි අතර, Ct අගය ලබා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණකරණය සිදු කළ හැක.නියැදි නොමැති ප්‍රතික්‍රියාවේ Ct අගය Ct අගයට වඩා පසුගාමී නම්, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ නිෂේධකය සාම්පලයේ පවතින බවත් ප්‍රතික්‍රියාවේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව වළක්වන බවත්ය.

05 Qubit fluorescent ඩයි ක්‍රමය

Qubit Fluorometer යනු න්‍යෂ්ටික අම්ල සාන්ද්‍රණය සහ සංශුද්ධතාවය හඳුනාගැනීම සඳහා බහුලව භාවිතා වන කුඩා උපාංගය වන අතර එය ක්‍රියා කිරීමට පහසු වන අතර සෑම අණුක ජීව විද්‍යා රසායනාගාරයකම පාහේ පවතී.එය නියුක්ලෙයික් අම්ලයේ සාන්ද්‍රණය හඳුනාගෙන නියුක්ලෙයික් අම්ල බන්ධන ප්‍රතිදීප්ත සායම් (Qubit හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකය) මගින් නිවැරදිව ගණනය කරයි.Qubit හට ඉහළ සංවේදීතාවයක් සහ විශේෂත්වයක් ඇති අතර, pg/µL සාන්ද්‍රණය දක්වා RNA නිවැරදිව ප්‍රමාණ කළ හැක.න්යෂ්ටික අම්ල සාන්ද්රණය නිවැරදිව ගණනය කිරීමේ සුප්රසිද්ධ හැකියාවට අමතරව, Thermo Fisher හි නවතම නව මාදිලිය, Qubit 4.0, RNA වල අඛණ්ඩතාව හඳුනා ගත හැකිය.Qubit 4.0′s RNA හඳුනාගැනීමේ පද්ධතිය (RNA IQ Assay) නිශ්චිත ප්‍රතිදීප්ත ඩයි වර්ග දෙකක් එකවර හඳුනා ගැනීමෙන් RNA හි අඛණ්ඩතාව හඳුනා ගනී.මෙම ප්‍රතිදීප්ත ඩයි වර්ග දෙක පිළිවෙලින් RNA විශාල කොටස් සහ කුඩා කොටස් වලට බන්ධනය විය හැක.මෙම ප්‍රතිදීප්ත ඩයි වර්ග දෙක මගින් නියැදියේ ඇති RNA විශාල කොටස්වල අනුපාතය පෙන්නුම් කරන අතර, මෙයින් RNA ගුණය නියෝජනය කරන IQ (අඛණ්ඩතාවය සහ ගුණාත්මකභාවය) අගය ගණනය කළ හැක.IQ අගය FFPE සහ FFPE නොවන සාම්පල දෙකටම අදාළ වන අතර, පසුකාලීන අනුක්‍රමික තත්ත්ව කෙරෙහි විශාල බලපෑමක් ඇති කරයි.NGS අත්හදා බැලීම් උදාහරණයක් ලෙස ගෙන, Ion ටොරන්ට්™ වේදිකාවේ සිදු කරන ලද RNA-Seq පරීක්ෂණ අත්හදා බැලීම් වලදී, IQ අගයන් 4 ට වඩා වැඩි බොහෝ සාම්පලවල අවම වශයෙන් 50% ඵලදායී කියවීම් තිබුණි (රූපය 5).ඉහත සඳහන් කළ හඳුනාගැනීමේ ක්‍රම හා සසඳන විට, Qubit IQ Assay ක්‍රියා කිරීමට වඩාත් පහසු වන අතර අඩු කාලයක් (විනාඩි පහක් ඇතුළත) ගත වනවා පමණක් නොව, මනින ලද පරාමිතිය IQ අගය සහ පහළ ප්‍රවාහයේ පරීක්ෂණවල දත්ත ගුණාත්මක භාවය අතර විශාල සහසම්බන්ධයක් ඇත.

රූප සටහන 5, Qubit RNA IQ අගය සහ RNA-Seq හි සිතියම්ගත කියවීම් අතර විශාල සහසම්බන්ධයක් ඇත.【5】

ඉහත හැඳින්වීම හරහා, විවිධ RNA තත්ත්ව පාලන ක්‍රම පිළිබඳව සෑම දෙනාටම ප්‍රමාණවත් අවබෝධයක් ඇති බව මම විශ්වාස කරමි.ප්රායෝගිකව, ඔබට තෝරා ගත හැකියනියැදි වර්ගය සහ පවතින උපකරණ අනුව අනුරූප ක්රමය.RNA වල ගුණාත්මක භාවය මැනවින් පාලනය කිරීමෙන් පමණක් දුර්වල සාම්පල ගුණාත්මක භාවය නිසා ඇති වූ පසුකාලීන අත්හදා බැලීම්වල අසාර්ථකත්වය වළක්වා ගත හැකි අතර එමඟින් වටිනා කාලය, ශක්තිය සහ පිරිවැය ඉතිරි වේ.

විමර්ශන නිෂ්පාදන:

සත්ව මුළු RNA හුදකලා කට්ටලය

සෛල සම්පූර්ණ RNA හුදකලා කට්ටලය

යොමු කිරීම්

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNA මිනුම් සඳහා අඛණ්ඩතා අගයන් පැවරීම සඳහා RNA අඛණ්ඩතා අංකයකි.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tsissue Sciences, P102, Voxic Isueological Science102, Voxic Issual Sciences, P202 වයස අවුරුදු 357-373,https://doi.org/10.1093/toxsci/