Pipette ඉඟි සහ EP නල වන්ධ්යාකරණය, ආදිය.
1. 0.1% (දහසෙන් එකක්) DEPC (අධික විෂ සහිත ද්රව්යයක්) deionized ජලය සමග සකස් කරන්න, එය දුම් ආවරණයක් තුළ ප්රවේශමෙන් භාවිතා කරන්න, සහ ආලෝකයෙන් 4 ° C දී එය ගබඩා කරන්න;
DEPC ජලය යනු DEPC සමඟ පිරිපහදු කළ පිරිසිදු ජලය වන අතර අධික උෂ්ණත්වය සහ අධික පීඩනය මගින් විෂබීජහරණය කරනු ලැබේ.RNase, DNase සහ proteinase වලින් තොර බවට පරීක්ෂා කර ඇත.
2. පයිප්ප තුඩ සහ EP බටය 0.1% DEPC තුළට දමා, පයිප්ප තුඩ සහ EP නළය 0.1% DEP වලින් පුරවා ඇති බව සහතික කර ගන්න.
3. ආලෝකයෙන් ආරක්ෂා වන්න, රැඳී සිටීමට ඉඩ දෙන්න, එක රැයකින් (පැ. 12-24)
4. ඔත්තුව සහ EP නළය අඩංගු පෙට්ටිය DEPC හි පොඟවා ගැනීම අවශ්ය නොවේ.තුණ්ඩයේ හෝ EP බටයේ ඇති DEPC ජලය දළ වශයෙන් ඉවත් කිරීමෙන් පසුව, එය ඇසුරුම් කර එය ඔතා ගන්න.
5. සෙල්සියස් අංශක 121, මිනිත්තු 30
6. සෙල්සියස් අංශක 180, පැය කිහිපයක් වියළන්න (අවම වශයෙන් පැය 3)
සටහන: a.DEPC හැසිරවීමේදී රබර් කිරි අත්වැසුම් සහ වෙස් මුහුණු පළඳින්න!b, හෝ DEPC වන්ධ්‍යාකරණයකින් තොරව, 130 ℃, 90min autoclave (බොහෝ රසායනාගාර ඉහළ උෂ්ණත්ව වන්ධ්යාකරණය දෙවරක්)
RNA නිස්සාරණය සලකා බැලීම්
පටක RNA හුදකලා අසාර්ථකත්වයේ ප්රධාන සංසිද්ධි දෙකක්
RNA ක්ෂය වීම සහ පටක වල ඇති අපද්‍රව්‍ය,හායනය සම්බන්ධයෙන්, අපි මුලින්ම බලමු සංස්කෘත සෛල වලින් ලබාගත් RNA පහසුවෙන් හායනය නොවන්නේ මන්දැයි.පවතින RNA නිස්සාරණ ප්‍රතික්‍රියාකාරක සියල්ලම RNase වේගයෙන් වළක්වන සංරචක අඩංගු වේ.සංස්කෘතික සෛල වලට ලයිසෙට් එකතු කරන්න, එය සරලව මිශ්ර කරන්න, සියලුම සෛල ලයිසෙට් සමඟ හොඳින් මිශ්ර කළ හැකි අතර, සෛල සම්පූර්ණයෙන්ම ලයිස්ඩ් කර ඇත.සෛල ලයිස් කළ පසු, ලයිසේට් හි ඇති ක්‍රියාකාරී අමුද්‍රව්‍ය වහාම අන්තර් සෛලීය RNase නිෂේධනය කරයි, එබැවින් RNA නොවෙනස්ව පවතී.එනම්, සංස්කෘත සෛල ලයිසේට් සමඟ පහසුවෙන් සහ සම්පූර්ණයෙන් සම්බන්ධ වන නිසා, ඒවායේ RNA පහසුවෙන් ක්ෂය නොවේ;අනෙක් අතට, පටකයේ ඇති සෛල ඉක්මනින් ලයිසේට් සමඟ සම්බන්ධ වීමට පහසු නොවන නිසා පටකයේ ඇති RNA පහසුවෙන් දිරාපත් වේ.ප්රමාණවත් සම්බන්ධතා නිසා.ඒ නිසා,RNA ක්රියාකාරිත්වය වළක්වමින් පටක තනි සෛලයක් බවට පත් කිරීමට ක්රමයක් ඇතැයි උපකල්පනය කළහොත්, ක්ෂය වීමේ ගැටලුව සම්පූර්ණයෙන්ම විසඳා ගත හැකිය.
ද්රව නයිට්රජන් ඇඹරීම එවැනි වඩාත් ඵලදායී ක්රමයකි.කෙසේ වෙතත්, දියර නයිට්රජන් ඇඹරුම් ක්රමය ඉතා කරදරකාරී ය, විශේෂයෙන් සාම්පල ගණන විශාල වන විට.මෙය මීළඟ හොඳම දේ ඇති කළේය: සමජාතීයකාරකය.එමසමජාතීයකාරකයලයිසේට් සමඟ සෛල සම්බන්ධ වීමට පෙර RNase ක්රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කරන්නේ කෙසේද යන ප්‍රශ්නය ක්රමය සලකා බලන්නේ නැත, නමුත් පටක කඩාකප්පල් වීමේ වේගය අන්තර් සෛලීය RNase RN පිරිහීමේ වේගයට වඩා වේගවත් වන ලෙස යාච්ඤා කරයි.
විද්යුත් සමජාතීයකාරකයේ බලපෑම වඩා හොඳය,සහ වීදුරු සමජාතීයකාරකයේ බලපෑම දුර්වලයි, නමුත් සාමාන්යයෙන්, සමජාතීය ක්රමයට පිරිහීමේ සංසිද්ධිය වැළැක්විය නොහැක.එබැවින්, නිස්සාරණය පිරිහෙන්නේ නම්, ද්රව නයිට්රජන් සමඟ ඇඹරීම සඳහා මුල් විද්යුත් සමජාතීයකාරකය භාවිතා කළ යුතුය;මුල් වීදුරු සමජාතීයකාරකය විද්යුත් සමජාතීය කාරකයක් බවට වෙනස් කළ යුතුය හෝ ද්රව නයිට්රජන් සමඟ සෘජුව අඹරන්න.ගැටලුව 100% පාහේ කළ හැකි ය.විසඳා ගන්න.
පසුකාලීන අත්හදා බැලීම්වලට බලපාන අපිරිසිදු අපද්‍රව්‍ය ගැටලුව පිරිහීමට වඩා විවිධ හේතු ඇති අතර විසඳුම් ඊට අනුරූපව වෙනස් වේ.අවසන් තීරණයේ දී,පටකවල ක්ෂය වීම හෝ අවශේෂ අපද්‍රව්‍ය තිබේ නම්, නිශ්චිත පර්යේෂණාත්මක ද්රව්ය සඳහා නිස්සාරණය කිරීමේ ක්රමය/ප්‍රතික්‍රියාකාරකය ප්‍රශස්ත කළ යුතුය.ප්‍රශස්තිකරණය සඳහා ඔබේ වටිනා සාම්පල භාවිතා කිරීමට අවශ්ය නැත: ඔබට මාළු/කුකුළු මස් වැනි කුඩා සතුන් වෙළඳපොලෙන් මිලදී ගත හැකිය, RNA නිස්සාරණය සඳහා ද්‍රව්‍යයේ අනුරූප කොටස ලබා ගත හැකිය, සහ ප්‍රෝටීන් නිස්සාරණය සඳහා අනෙක් කොටස - මුඛයෙන්, ආමාශයෙන් සහ බඩවැල් වලින් අඹරන්න.
නිස්සාරණය කරන ලද RNA හි ඉලක්ක RNA විවිධ පසු විපරම් පරීක්ෂණ සඳහා භාවිතා කරන අතර එහි ගුණාත්මක අවශ්යතා වෙනස් වේ
cDNA පුස්තකාල ඉදිකිරීම සඳහා එන්සයිම ප්රතික්රියා නිෂේධකවල අපද්‍රව්‍ය නොමැතිව RNA අඛණ්ඩතාව අවශ්ය වේ;උතුරට එන්සයිම ප්රතික්රියා නිෂේධක අපද්‍රව්‍ය සඳහා ඉහළ RNA අඛණ්ඩතාව සහ අඩු අවශ්යතා අවශ්ය වේ;RT-PCR සඳහා ඉතා ඉහළ RNA අඛණ්ඩතාවක් අවශ්ය නොවේ,නමුත් එන්සයිම ප්රතික්රියා වළක්වයි.අවශේෂ අවශ්යතා දැඩි වේ.ආදානය නිමැවුම තීරණය කරයි;ඉහළම සංශුද්ධතාවයෙන් යුත් ආර්එන්ඒ ලබා ගැනීම ඉලක්කය වන සෑම අවස්ථාවකම, ඒ සඳහා මිනිසුන් සහ මුදල් වැය වේ.
සාම්පල එකතු කිරීම / ගබඩා කිරීම
පරිහානියට බලපාන සාධක නියැදිය ජීවී ශරීරයෙන්/හෝ මුල් වර්ධන පරිසරයෙන් ඉවත් වූ පසු, නියැදියේ ඇති අන්තරාසර්ග එන්සයිම RNA හායනය වීමට පටන් ගනී.සහ ක්ෂය වීමේ අනුපාතය ආවේණික එන්සයිම සහ උෂ්ණත්වයේ අන්තර්ගතයට සම්බන්ධ වේ.සම්ප්‍රදායිකව, අන්තරාසර්ග එන්සයිම ක්රියාකාරිත්වය සම්පූර්ණයෙන්ම නිෂේධනය කිරීමට ඇත්තේ ක්‍රම දෙකක් පමණි: වහාම ලයිසේට් එකතු කර හොඳින් හා වේගයෙන් සමජාතීය කරන්න;කුඩා කැබලිවලට කපා වහාම දියර නයිට්රජන් තුළ කැටි කරන්න.ප්රවේශයන් දෙකම වේගවත් මෙහෙයුමක් අවශ්ය වේ.දෙවැන්න සියලුම සාම්පල සඳහා සුදුසු වන අතර, පළමුවැන්න සුදුසු වන්නේ අඩු සෛල සහ ආවේණික එන්සයිම සහිත පටක සඳහා පමණක් වන අතර සමජාතීය කිරීමට පහසුය.නිශ්චිතවම, ශාක පටක, අක්මාව, තයිමස්, අග්න්‍යාශය, ප්ලීහාව, මොළය, මේදය, මාංශ පේශි පටක යනාදිය ඉදිරියට යාමට පෙර ද්රව නයිට්රජන් සමඟ වඩාත් හොඳින් ශීත කළ යුතුය.
සාම්පල ඛණ්ඩනය සහ සමජාතීයකරණය
හායනය සහ අස්වැන්න නියැදි ඛණ්ඩනයට බලපාන සාධක වේසම්පූර්ණ සමජාතීයකරණය සඳහා, එය RNA සම්පූර්ණ සහ සම්පූර්ණ මුදා හැරීම සඳහා වේ.සෛල කැඩී යාමකින් තොරව සෘජුවම සමජාතීය කළ හැක.පටක සමජාතීය කළ හැක්කේ කැඩී ගිය පසුව පමණි.යීස්ට් සහ බැක්ටීරියා සමජාතීය වීමට පෙර අනුරූප එන්සයිම සමඟ බිඳ දැමිය යුතුය.අඩු අන්තරාසර්ග එන්සයිම අන්තර්ගතයක් සහ පහසු සමජාතීයකරණයක් සහිත පටක සමජාතීය කාරකයක් මගින් ලයිසේට් තුළ එකවර තලා සමජාතීය කළ හැකිය;ශාක පටක, අක්මාව, තයිමස්, අග්න්‍යාශය, ප්ලීහාව, මොළය, මේදය, මාංශ පේශි පටක සහ අනෙකුත් සාම්පල, ඒවා අන්තරාසර්ග එන්සයිම වලින් ඉහළ මට්ටමක පවතී හෝ පහසුවෙන් සමජාතීය නොවේ.එබැවින් පටක කඩාකප්පල් කිරීම සහ සමජාතීයකරණය වෙන වෙනම සිදු කළ යුතුය.ඛණ්ඩනය කිරීමේ වඩාත්ම විශ්වාසදායක හා ඵලදායී ක්රමය වන්නේ ද්රව නයිට්රජන් සමඟ ඇඹරීම වන අතර සමජාතීය කිරීමේ වඩාත් විශ්වාසදායක ක්රමය වන්නේ විද්යුත් සමජාතීයකාරකයක් භාවිතා කිරීමයි.දියර නයිට්රජන් සමඟ ඇඹරීම පිළිබඳ විශේෂ සටහනක්: ශීත කළ විට ආවේණික එන්සයිම ක්‍රියා කිරීමට වැඩි ඉඩක් ඇති බැවින්, සම්පූර්ණ ඇඹරීමේ ක්‍රියාවලියේදී නියැදිය දිය නොකළ යුතුය.
ලයිසේට් තෝරා ගැනීම
ක්‍රියාකාරීත්වයේ පහසුව සහ අවශේෂ ආවේණික අපද්‍රව්‍යවල සාධක කෙරෙහි බලපෑම් කිරීම බහුලව භාවිතා වන ලිසිස් විසඳුම් RNase හි ක්රියාකාරිත්වය පාහේ වළක්වයි.එබැවින්, ලිසිස් විසඳුමක් තෝරාගැනීමේ ප්රධාන කරුණ වන්නේ පවිත්ර කිරීමේ ක්රමය සමඟ ඒකාබද්ධව සලකා බැලීමයි.එක් ව්යතිරේකයක් ඇත:අන්තරාසර්ග එන්සයිම අක්‍රිය කිරීමේ හැකියාව වැඩි කිරීම සඳහා ෆීනෝල් අඩංගු ලයිසේට් භාවිතා කිරීම සඳහා ඉහළ ආවේණික එන්සයිම අන්තර්ගතයක් සහිත සාම්පල නිර්දේශ කෙරේ.
පිරිසිදු කිරීමේ ක්රමය තෝරා ගැනීම
අවශේෂ ආවේණික අපද්‍රව්‍ය කෙරෙහි බලපාන සාධක, නිස්සාරණය කිරීමේ වේගය සෛල වැනි පිරිසිදු සාම්පල සඳහා, ඕනෑම පිරිසිදු කිරීමේ ක්රමයක් අතැතිව සතුටුදායක ප්‍රතිඵල ලබා ගත හැක.නමුත් වෙනත් බොහෝ සාම්පල සඳහා, විශේෂයෙන් ශාක, අක්මාව, බැක්ටීරියා වැනි ඉහළ මට්ටමේ අපිරිසිදුකම් ඇති ඒවා සඳහා සුදුසු පිරිසිදු කිරීමේ ක්රමයක් තෝරා ගැනීම ඉතා වැදගත් වේ.තීරු කේන්ද්රාපසාරී පවිත්ර කිරීමේ ක්රමයට වේගවත් නිස්සාරණ වේගයක් ඇති අතර RNA හි පසුකාලීන එන්සයිම ප්‍රතික්‍රියාවට බලපාන අපද්‍රව්‍ය ඵලදායි ලෙස ඉවත් කළ හැකි නමුත් එය මිල අධිකය (Foregene මගින් ලාභදායී කට්ටල ලබා දිය හැක, වැඩි විස්තර ක්ලික් කරන්න.මෙතන);LiCl වර්ෂාපතනය වැනි ආර්ථිකමය සහ සම්භාව්ය පිරිසිදු කිරීමේ ක්‍රම භාවිතා කිරීමෙන්ද සතුටුදායක ප්‍රතිඵල ලබා ගත හැක, නමුත් මෙහෙයුම් කාලය දිගු වේ..
RNA නිස්සාරණය සඳහා "විනය තුනක් සහ අවධානය අටක්"
විනය 1:බාහිර එන්සයිම දූෂණය කිරීම අවසන් කරන්න.
සටහන 1:මුඛ ආවරණ සහ අත්වැසුම් දැඩි ලෙස පළඳින්න.
සටහන 2:පර්යේෂණයට සම්බන්ධ වූ කේන්ද්රාපසාරී නල, ඉඟි හිස්, නල දඬු, විද්යුත් විච්ඡේදක ටැංකි සහ පර්යේෂණාත්මක බංකු හොඳින් බැහැර කළ යුතුය.
සටහන 3:පර්යේෂණයට සම්බන්ධ ප්‍රතික්‍රියාකාරක/විසඳුම්, විශේෂයෙන්ම ජලය, RNase-නිදහස් විය යුතුය.
විනය 2:ආවේණික එන්සයිම වල ක්රියාකාරිත්වය අවහිර කරන්න
සටහන 4:සුදුසු සමජාතීය ක්රමයක් තෝරන්න.
සටහන 5:සුදුසු ලයිසේට් එකක් තෝරන්න.
සටහන 6:නියැදියේ ආරම්භක ප්රමාණය පාලනය කරන්න.
විනය 3:ඔබේ නිස්සාරණය කිරීමේ අරමුණ පැහැදිලි කරන්න
සටහන 7:ඕනෑම ලයිසේට් පද්ධතියක් නියැදියේ උපරිම ආරම්භක ප්‍රමාණයට ළඟා වීමත් සමඟ, නිස්සාරණ සාර්ථකත්ව අනුපාතය තියුනු ලෙස පහත වැටේ.
සටහන 8:සාර්ථක RNA නිස්සාරණය සඳහා ඇති එකම ආර්ථික නිර්ණායකය වන්නේ අස්වැන්න නොව පසුකාලීන අත්හදා බැලීම්වල සාර්ථකත්වයයි.
RNase දූෂණයේ ඉහළම මූලාශ්‍ර 10
1. බාහිර එන්සයිමවල පළමු ප්‍රභවය ඇඟිලි වන අතර, එබැවින් අත්වැසුම් නිතර පැළඳිය යුතු අතර ඒවා නිතර ප්‍රතිස්ථාපනය කළ යුතුය.ඊට අමතරව, වෙස් මුහුණු පැළඳිය යුතුය, මන්ද හුස්ම ගැනීම ද එන්සයිමවල වැදගත් ප්‍රභවයකි.අත්වැසුම් ආවරණයක් පැළඳීමේ අමතර වාසියක් වන්නේ අත්හදා බැලීම් කරන්නා ආරක්ෂා කිරීමයි.
2. නල ඉඟි, කේන්ද්රාපසාරී නල, පයිප්ප - RNase වන්ධ්‍යාකරණයෙන් පමණක් අක්‍රිය කළ නොහැක, එබැවින් පයිප්ප ඉඟි සහ කේන්ද්රාපසාරී නල DEPC සලකුණක් ලෙස සලකුණු කළද, DEPC සමඟ ප්‍රතිකාර කළ යුතුය.විශේෂ කාර්ය පයිප්පයක් භාවිතා කිරීම වඩාත් සුදුසුය, භාවිතයට පෙර 75% ඇල්කොහොල් කපු බෝලයකින් පිස දමන්න, විශේෂයෙන් සැරයටිය;ඊට අමතරව, හිස ඉවත් කරන්නෙකු භාවිතා නොකිරීමට වග බලා ගන්න.
3. ජලය/බෆරය RNase දූෂණයෙන් තොර විය යුතුය.
4. අවම වශයෙන් පරීක්ෂණ මේසය 75% ඇල්කොහොල් කපු බෝල වලින් පිස දැමිය යුතුය.
5.Endogenous RNase සියලුම පටක වල ආවේණික එන්සයිම අඩංගු වේ, එබැවින් ද්රව නයිට්රජන් සමඟ පටක ඉක්මනින් කැටි කිරීම දිරාපත් වීම අවම කිරීමට හොඳම ක්‍රමයයි.දියර නයිට්රජන් ගබඩා කිරීම/ඇඹරීමේ ක්රමය ඇත්තෙන්ම අපහසුයි, නමුත් අන්තරාසර්ග එන්සයිම ඉහළ මට්ටමක පවතින පටක සඳහා ඇති එකම ක්රමය එයයි.
6. RNA සාම්පල RNA නිස්සාරණ නිෂ්පාදනවල RNase දූෂණයේ අංශු අඩංගු විය හැක.
7. ප්ලාස්මිඩ් නිස්සාරණය ප්ලාස්මිඩ් නිස්සාරණය බොහෝ විට RNA හායනය කිරීමට Rnase භාවිතා කරයි, සහ ඉතිරි Rnase ප්‍රෝටීන් K සමඟ දිරවා PCI මගින් නිස්සාරණය කළ යුතුය.
8. RNA ආචයනය අඩු උෂ්ණත්වයකදී ගබඩා කළද, RNase හි සුළු ප්‍රමාණයන් RNA ක්ෂය වීමට හේතු වේ.ඇල්කොහොල් අඩු උෂ්ණත්වවලදී සියලුම එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් වලක්වන නිසා RNA දිගු කාලීනව සංරක්ෂණය කිරීම සඳහා හොඳම විසඳුම ලුණු/මත්පැන් අත්හිටුවීමයි.
9. කැටායන (Ca, Mg) මෙම අයන අඩංගු වන විට, විනාඩි 5 ක් සඳහා 80C දී රත් කිරීම RNA කැඩීමට හේතු වේ, එබැවින් RNA රත් කිරීමට අවශ්ය නම්, කල් තබා ගැනීමේ ද්‍රාවණය තුළ chelating agent (1mM සෝඩියම් සයිටේ්‍රට්, pH 6.4) අඩංගු විය යුතුය.
10. පසුකාලීන අත්හදා බැලීම් වලදී භාවිතා කරන එන්සයිම RNase මගින් දූෂිත විය හැක.
RNA නිස්සාරණය සඳහා උපදෙස් 10 ක්
1: ඉක්මනින් RNase ක්‍රියාකාරකම් වලක්වන්න.නියැදි එකතු කිරීමෙන් පසු ඉක්මනින් ශීත කළ අතර, ලයිසිස් තුළ වේගවත් ක්‍රියාකාරිත්වයකින් RNase අක්‍රිය වේ.
2: ඉහළ රයිබොසයිම් අන්තර්ගතයක් සහිත පටක සඳහා සුදුසු නිස්සාරණ ක්රමයක් තෝරන්න, සහ ඇඩිපෝස් පටක ෆීනෝල් අඩංගු ක්රමය භාවිතා කිරීම වඩාත් සුදුසුය.
3: පුරෝකථන ගුණාත්මක භාවය සඳහා උතුරු, cDNA පුස්තකාල ඉදිකිරීම සඳහා ඉහළ අඛණ්ඩතාව අවශ්ය වන අතර RT-PCR සහ RPA (Ribonuclease protection assay) සඳහා ඉහළ අඛණ්ඩතාව අවශ්ය නොවේ.RT-PCR සඳහා ඉහළ සංශුද්ධතාවය (එන්සයිම නිෂේධක අවශේෂ) අවශ්ය වේ.
4: සම්පූර්ණ සමජාතීයකරණය අස්වැන්න වැඩි දියුණු කිරීම සහ හායනය අඩු කිරීම සඳහා යතුරයි.
5: RNA ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් හඳුනාගැනීමේ අඛණ්ඩතාව පරීක්ෂා කරන්න, 28S: 18S = 2: 1 සම්පූර්ණ ලකුණකි, 1: 1 බොහෝ අත්හදා බැලීම් සඳහා ද පිළිගත හැකිය.
6: RT-PCR සඳහා DNA ඉවත් කිරීම, අරා විශ්ලේෂණය DNA ඉවත් කිරීම සඳහා Dnase I භාවිතා කිරීම වඩාත් සුදුසුය.
7: බාහිර එන්සයිම දූෂණය අඩු කරන්න - එන්සයිම පිටතින් ආනයනය කළ නොහැක.
8: අඩු සාන්ද්‍රණයෙන් යුත් න්යෂ්ටික අම්ලය සාන්ද්‍රණය කරන විට, සම වර්ෂාපතන ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් එකතු කළ යුතුය.නමුත් එන්සයිම සහ ඩී.එන්.ඒ.
9: RNA තරයේ දියකර, අවශ්ය නම්, 65C දී විනාඩි 5ක් රත් කරන්න.
සුදුසු ගබඩා ක්රමය
එය -20C දී කෙටි කාලයක් සහ -80C දී දිගු කාලයක් ගබඩා කළ හැක.RNA අස්වැන්න වැඩි දියුණු කිරීමේ පළමු පියවර වන්නේ විවිධ සාම්පලවල RNA අන්තර්ගතය බොහෝ සෙයින් වෙනස් වන බව අවබෝධ කර ගැනීමයි.අක්මාව, අග්න්‍යාශය, හෘදය, මොළය, කලලරූපය, වකුගඩු, පෙනහළු, තයිමස්, ඩිම්බකෝෂය වැනි මධ්‍යම බහුලත්වය (0.05-2ug/mg) වැනි ඉහළ බහුලත්වය (2-4ug/mg) මුත්‍රාශය, අස්ථි, මේදය වැනි අඩු බහුලත්වය (<0.05ug/mg) mg.
1: RN මුදා හැරීමට සෛල ලයිස් කරන්න - RNA නිදහස් නොකළහොත් අස්වැන්න අඩු වේ.විද්යුත් සමජාතීයකරණය අනෙකුත් සමජාතීරණ ක්‍රමවලට වඩා හොඳින් ක්‍රියා කරයි, නමුත් ද්රව නයිට්රජන් මැසීම, එන්සයිම ජීර්ණය (Lysozyme/Lyticase) වැනි වෙනත් ක්‍රම සමඟ ඒකාබද්ධ කිරීමටද අවශ්ය විය හැක.
2: නිස්සාරණ ක්රමය ප්‍රශස්ත කිරීම.ෆීනෝල් මත පදනම් වූ ක්‍රමවල ඇති විශාලතම ගැටළු වන්නේ අසම්පූර්ණ ස්තරීකරණය සහ අර්ධ ආර්එන්ඒ අලාභයයි (සුපිරි ප්‍රවාහය සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් කළ නොහැක).අසම්පූර්ණ ස්තරීකරණය ඉහළ නියුක්ලෙයික් අම්ලය සහ ප්‍රෝටීන් අන්තර්ගතය නිසා වන අතර, භාවිතා කරන ලයිසේට් ප්රමාණය වැඩි කිරීමෙන් හෝ නියැදි ප්රමාණය අඩු කිරීමෙන් විසඳිය හැකිය.ක්ලෝරෝෆෝම් නිස්සාරණය කිරීමේ පියවරක් ඇඩිපෝස් පටකයට එකතු කරන ලදී.පසුපසට පොම්ප කිරීමෙන් හෝ කාබනික ස්ථරය ඉවත් කිරීමෙන් පසුව කේන්ද්රාපසාරී කිරීමෙන් RNA පාඩුව අඩු කළ හැක.තීරු කේන්ද්රාපසාරී පාදක ක්‍රමවල ඇති ලොකුම ගැටලුව වන්නේ අතිරික්ත නියැදියයි.
සම්භාව්ය නිස්සාරණ ඉඟි
1. ෆීනෝල් පිරිසිදු කිරීම: 1: 1 ෆීනෝල් / ක්ලෝරෝෆෝම් සමාන පරිමාවක් එකතු කර විනාඩි 1-2 ක් සඳහා දැඩි ලෙස මිශ්ර කරන්න.මිනිත්තු 2 ක් සඳහා අධික වේගයෙන් කේන්ද්රාපසාරී.සුපර්නැටන්ට් (80-90%) ප්රවේශමෙන් ඉවත් කරන්න.කිසි විටෙකත් මැද ස්ථරයට නොයන්න.ප්රතික්රියා ද්‍රාවණයේ සමාන පරිමාවක් ෆීනෝල්/ක්ලෝරෝෆෝම් වලට එකතු කර අධි ප්‍රවාහය ඉවත් කළ හැක.අස්වැන්න වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා න්යෂ්ටික අම්ල වර්ෂාපතනය සඳහා සුපිරි ද්රව්ය දෙක එකට මිශ්ර කළ හැක.මිශ්ර කිරීමේදී ඉතා මෘදු නොවිය යුතු අතර, සියලු සුපිරි ද්රව්ය ඉවත් කිරීමට උත්සාහ නොකරන්න.
2. 70-80% එතනෝල් සමඟ සේදීම: සේදීමේදී, ඉතිරි ලුණු සෝදා ඉවත් කිරීම සහතික කිරීම සඳහා න්යෂ්ටික අම්ලය අත්හිටුවිය යුතුය.ඒ අතරම, එතනෝල් වත් කළ වහාම, තත්පර කිහිපයක් සඳහා අධික වේගයෙන් කේන්ද්රාපසාරී කර, පසුව පයිප්පයකින් ඉතිරි එතනෝල් ඉවත් කරන්න.5-10 විනාඩි කාමර උෂ්ණත්වයේ රැඳී සිටීමෙන් පසු විසුරුවා හරින්න.
11. විශේෂ සංවිධාන උපුටා ගැනීම
1. තන්තුමය පටක: හෘදය/අස්ථි මාංශ පේශී වැනි තන්තුමය පටක වලින් RNA නිස්සාරණය කිරීමේ යතුර වන්නේ පටක සම්පූර්ණයෙන්ම කඩාකප්පල් කිරීමයි.මෙම පටක වල සෛල ඝනත්වය අඩු බැවින් පටක ඒකක බරකට RNA ප්රමාණය අඩු වන අතර හැකිතාක් ආරම්භක ප්රමාණය භාවිතා කිරීම වඩාත් සුදුසුය.ශීත කළ තත්වයන් යටතේ පටක හොඳින් ඇඹරීමට වග බලා ගන්න.
2. ප්‍රෝටීන්/මේද ප්රමාණය අධික පටක: මොළය/එළවළු මේද ප්රමාණය ඉහළයි.PCI නිස්සාරණයෙන් පසුව, අධි ප්‍රවාහයේ සුදු ෆ්ලෝකියුලස් අඩංගු වේ.ක්ලෝරෝෆෝම් සමඟ අධි ප්‍රවාහය නැවත නිස්සාරණය කළ යුතුය.
3. ඉහළ න්යෂ්ටික අම්ල/රයිබොසයිම් අන්තර්ගතයක් සහිත පටක: ප්ලීහාව/තයිමස් හි ඉහළ න්යෂ්ටික අම්ලයක් සහ රයිබොසයිම් අන්තර්ගතයක් ඇත.සීඝ්‍ර සමජාතීයකරණයෙන් පසුව ශීතකරණ තත්ත්ව යටතේ ඇඹරුම් පටක රයිබොසයිම ඵලදායී ලෙස අක්‍රිය කළ හැක.කෙසේ වෙතත්, ලයිසේට් ඉතා දුස්ස්රාවී නම් (ඉහළ න්යෂ්ටික අම්ල අන්තර්ගතය නිසා), PCI නිස්සාරණය ඵලදායී ලෙස ස්ථරීකරණය කිරීමට නොහැකි වනු ඇත;තවත් ලයිසේට් එකතු කිරීමෙන් මෙම ගැටළුව විසඳා ගත හැකිය.බහුවිධ PCI නිස්සාරණයන් වැඩිපුර අවශේෂ DNA ඉවත් කළ හැක.ඇල්කොහොල් එකතු කළ වහාම සුදු අවක්ෂේපයක් සෑදෙන්නේ නම්, එය DNA දූෂණය පෙන්නුම් කරයි.විසුරුවා හැරීමෙන් පසු ආම්ලික PCI සමඟ නැවත නිස්සාරණය කිරීමෙන් DNA දූෂණය ඉවත් කළ හැකිය.
4. ශාක පටක: ශාක පටක සත්ව පටක වලට වඩා සංකීර්ණ වේ.සාමාන්යයෙන්, ශාක ද්රව නයිට්රජන් තත්ත්‍වයන් යටතේ අඹරනු ලැබේ, එබැවින් ආවේණික එන්සයිම මගින් RNA ක්ෂය වීම සාමාන්‍ය දෙයක් නොවේ.දිරාපත්වීමේ ගැටළුව විසඳා නොමැති නම්, එය නිසැකවම නියැදියේ අඩංගු අපිරිසිදුකම් නිසා ඇතිවේ.බොහෝ ශාකවල අඩංගු අපද්‍රව්‍ය අපද්‍රව්‍යවලට තුඩු දෙනු ඇති අතර, අපද්‍රව්‍ය සඳහා හේතුව බොහෝ විට මෙම අපද්‍රව්‍ය RNA සමඟ යම් සමානකම් ඇති බැවිනි: ඔබ අවක්ෂේප කරයි සහ මම අවක්ෂේප කරයි, ඔබ අවශෝෂණය කරයි සහ මම අවශෝෂණය කරයි.මෙම ලක්ෂණ ඔවුන් ඉතා ශක්තිමත් එන්සයිම නිෂේධක බව තීරණය කරයි.
වර්තමානයේ, වානිජ RNA නිස්සාරණ ප්‍රතික්‍රියාකාරක කුඩා ගැලපීම් සහිත සියලුම සත්ව පටක සඳහා අනුවර්තනය කළ හැකි නමුත් බොහෝ ශාක පටක සඳහා සුදුසු වාණිජ RNA නිස්සාරණ ප්‍රතික්‍රියාකාරක ස්වල්පයක් ඇත.වාසනාවකට මෙන්, Foregene විශේෂ සැපයිය හැකියශාක RNA නිස්සාරණ කට්ටල, අපිට තියෙනවාශාක සම්පූර්ණ RNA හුදකලා කට්ටලය, ශාක සම්පූර්ණ RNA හුදකලා කට්ටලය ප්ලස්.දෙවැන්න විශේෂයෙන් නිර්මාණය කර ඇත්තේ ඉහළ පොලිසැකරයිඩ සහ පොලිෆෙනෝල් අන්තර්ගතය සහිත ශාක සඳහා ය.RNA නිස්සාරණය සඳහා, විද්‍යාගාර භාවිතා කරන්නන්ගේ ප්‍රතිපෝෂණය විශේෂයෙන් යහපත් වේ.
12. නියැදි කැටි කිරීම සහ දියවීමේ බලපෑම ශීත කළ නියැදිය විශාල විය හැකි අතර, RNA නිස්සාරණය සඳහා භාවිතා කිරීමට පෙර එය කපා දැමීම අවශ්ය වේ.සාම්පල කැපීමේදී (සමහරවිට අර්ධ වශයෙන්) දියවීමට නැඹුරු වේ.RNA නිස්සාරණයට පෙර ශීත කළ සාම්පල කිරා බැලීම අවශ්ය විය හැකි අතර, මෙම ක්‍රියාවලියේදී දියවීම නියත වශයෙන්ම සිදුවනු ඇත.සමහර විට, දියර නයිට්රජන් ඇඹරීමේ ක්‍රියාවලියේදී නියැදිය දියවීම ද සිදු වේ;හෝ ශීත කළ නියැදිය ද්රව නයිට්රජන් ඇඹරීමකින් තොරව ලයිසෙට් වෙත සෘජුවම එකතු කරනු ලබන අතර, සම්පූර්ණ සමජාතීයතාවයට පෙර දියවීම අනිවාර්යයෙන්ම සිදුවනු ඇත.නැවුම් පටක වලට වඩා ශීත කළ පටක දියවීමේදී RNA හායනය වීමේ ප්‍රවණතාව වැඩි බව පර්යේෂණවලින් පෙන්වා දී ඇත.විය හැකි හේතුව: කැටි- දියවන ක්‍රියාවලිය සෛලය තුළ ව්‍යුහයන් කඩාකප්පල් කරයි, ආවේණික එන්සයිම RNA සමඟ සෘජුව සම්බන්ධ වීම පහසු කරයි.
13. RNA තත්ත්ව විනිශ්චය සාමාන්යයෙන්, RNA හි අඛණ්ඩතාව විනිශ්චය කිරීමට විද්යුත් විච්ඡේදනය භාවිතා කරන අතර RNA හි සංශුද්ධතාවය විනිශ්චය කිරීමට A260/A280 භාවිතා වේ.න්‍යායාත්මකව, නොවෙනස්ව පවතින RNA 28S:18S = 2.7:1 අනුපාතයක් ඇති අතර, බොහෝ දත්ත 28S:18S = 2:1 අනුපාතය අවධාරණය කරයි.සත්‍යය නම් සෛල හැර වෙනත් සාම්පල වලින් ලබාගත් RNA කිසිවක් පාහේ 2:1 අනුපාතයකින් නොමැති වීමයි (මෙය ලබා ගත්තේ Agilent Bioanalyzer භාවිතා කරමිනි).
RNA හි විද්යුත් විච්ඡේදක ප්‍රතිඵල ද්විතියික ව්‍යුහය, විද්යුත් විච්ඡේදක තත්ත්‍වයන්, නියැදි භාරය, EB මගින් සන්තෘප්තියේ මට්ටම යනාදිය ඇතුළු බොහෝ සාධක මගින් බලපායි.2kb හි 28S සහ 0.9kb හි 18S පැහැදිලි නම් සහ 28S: 18S > 1 නම්, අඛණ්ඩතාවයට පසුකාලීන බොහෝ අත්හදා බැලීම්වල අවශ්යතා සපුරාලිය හැක.
A260/A280 යනු බොහෝ ව්‍යාකූලත්වයට හේතු වූ දර්ශකයකි.පළමුවෙන්ම, න්යෂ්ටික අම්ල සඳහා මෙම දර්ශකයේ මුල් අර්ථය පැහැදිලි කිරීම අවශ්ය වේ: පිරිසිදු RNA, එහි A260/280 = 2.0 පමණ වේ.පිරිසිදු RNA යනු 'හේතුව' වන අතර A260/A280 = 2 'ඵලය' වේ.දැන් හැමෝම A260/A280 'හේතුවක්' ලෙස භාවිතා කරන්නේ, "A260/A280 = 2 නම්, RNA පිරිසිදුයි" කියා සිතා, එය ස්වභාවිකවම ව්‍යාකූලත්වයට හේතු වේ.
ඔබ කැමති නම්, ඔබට ඔබේ RNA සාම්පලයට phenol, guanidine isothiocyanate, PEG වැනි නිස්සාරණයේදී නිතර භාවිතා කරන කුඩා ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් එකතු කර A260/A280 අනුපාතය මැනිය හැක.යථාර්ථය නම්, RNA නිස්සාරණය සඳහා භාවිතා කරන බොහෝ ප්‍රතික්‍රියාකාරක මෙන්ම නියැදියේ ඇති බොහෝ අපද්‍රව්‍ය A260 සහ A280 පමණ අවශෝෂණය කර A260/A280 ට බලපායි.
දැනට වඩාත්ම උපදේශාත්මක ප්‍රවේශය වන්නේ 200-300 nm පරාසයක RNA සාම්පල පරිලෝකනය කිරීමයි.පිරිසිදු RNA වල වක්‍රය පහත ලක්ෂණ ඇත: වක්‍රය සිනිඳුයි, A230 සහ A260 විභේදන ස්ථාන දෙකකි, A300 0 ට ආසන්න වේ, A260/A280 = 2.0 පමණ වන අතර A260/A230 = 2.0 පමණ වේ.ස්කෑන් දත්ත නොමැති නම්, එන්සයිම ප්‍රතික්‍රියාවට බලපාන සියලුම අපද්‍රව්‍ය රැගෙන යාමට මෙම අනුපාතය වඩාත් සංවේදී බැවින්, A260/A230 අනුපාතය ද තීරණය කළ යුතුය.උපාංගයේ රේඛීය පරාසය (A260 සඳහා 0.1-0.5) සැලකිල්ලට ගන්න.
තවත් ප්‍රයෝජනවත් සංසිද්ධි දෙකක් තිබේ: A260/A280 ජලයේ මනින විට අනුපාතය 0.3ක් පමණ අඩු වනු ඇත;10 mM EDTA හි මනින ලද අනුපාතය 1 mM EDTA හි මනින ලද අනුපාතයට වඩා 0.2 ක් පමණ වැඩි වේ.
ආශ්රිත නිෂ්පාදන:
China Plant Total RNA Isolation Kit නිෂ්පාදකයා සහ සැපයුම්කරු |Foregene (foreivd.com)
RNA හුදකලා මාලාව - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
පසු කාලය: ජූලි-15-2022
