අපි පළපුරුදු නිෂ්පාදකයෙක්.Big discounting China High Sensitivity One-Probe Rt- සඳහා එහි වෙළඳපොලේ තීරණාත්මක සහතික වලින් බහුතරයක් දිනා ගැනීම.QpcrKit V2, ගුණාත්මකභාවය යනු කර්මාන්තශාලා ජීවිතයයි, පාරිභෝගික ඉල්ලුම කෙරෙහි අවධානය යොමු කිරීම සමාගමේ පැවැත්මේ සහ සංවර්ධනයේ මූලාශ්‍රයයි, අපි අවංකභාවය සහ යහපත් විශ්වාසයෙන් වැඩ කරන ආකල්පය පිළිපදින්නෙමු, ඔබගේ පැමිණීම අපේක්ෂාවෙන් සිටිමු!
අපි පළපුරුදු නිෂ්පාදකයෙක්.එහි වෙළඳපොළේ තීරණාත්මක සහතිකවල බහුතරයක් දිනා ගැනීමChina Taq DNA පොලිමරේස්, Qpcr, අපගේ සමාගම පොරොන්දු වේ: සාධාරණ මිල ගණන්, කෙටි නිෂ්පාදන කාලය සහ තෘප්තිමත් අලෙවියෙන් පසු සේවාව, ඔබට අවශ්‍ය ඕනෑම වේලාවක අපගේ කර්මාන්ත ශාලාවට පැමිණීමට අපි ඔබව සාදරයෙන් පිළිගනිමු.දැන් අපි එකට ප්‍රසන්න හා දිගුකාලීන ව්‍යාපාරයක් කිරීමට ප්‍රාර්ථනා කරමු!!!

විස්තර

මෙම කට්ටලය RT-qPCR ප්‍රතික්‍රියා සඳහා සංස්කෘත සෛල සාම්පල වලින් RNA ඉක්මනින් මුදා හැරිය හැකි අද්විතීය ලයිසිස් බෆර පද්ධතියක් භාවිතා කරයි, එමඟින් කාලය ගතවන සහ වෙහෙසකාරී RNA පිරිසිදු කිරීමේ ක්‍රියාවලිය ඉවත් කරයි.RNA අච්චුව විනාඩි 7කින් ලබා ගත හැක.කට්ටලය මඟින් සපයනු ලබන 5×Direct RT මිශ්‍රණය සහ 2×Direct qPCR Mix-SYBR ප්‍රතික්‍රියාකාරක මඟින් තත්‍ය කාලීන ප්‍රමාණාත්මක PCR ප්‍රතිඵල ඉක්මනින් හා ඵලදායී ලෙස ලබා ගත හැක.

5×Direct RT Mix සහ 2×Direct qPCR Mix-SYBR ශක්තිමත් නිෂේධක ඉවසීමක් ඇති අතර, සාම්පලවල ලයිසේට් සෘජුවම RT-qPCR සඳහා අච්චුව ලෙස භාවිතා කළ හැක.මෙම කට්ටලය තුළ අද්විතීය RNA අධි-සම්බන්ධතා Foregene ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ Hot D-Taq DNA පොලිමරේස්, dNTPs, MgCl අඩංගු වේ.₂, ප්‍රතික්‍රියා බෆරය, PCR ප්‍රශස්තකරණය සහ ස්ථායීකාරකය.

පිරිවිතර

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

කට්ටල සංරචක

විශේෂාංග සහ වාසි

■ සරල සහ ඵලදායී : Cell Direct RT තාක්ෂණය සමඟින්, RNA සාම්පල විනාඩි 7කින් ලබා ගත හැක.

■ නියැදි ඉල්ලුම කුඩා වන අතර, සෛල 10ක් තරම් අඩු ප්‍රමාණයක් පරීක්ෂා කළ හැක.

■ ඉහළ ප්‍රතිදානය: එය 384, 96, 24, 12, 6-ළිං තහඩු තුළ වගා කරන ලද සෛල තුළ RNA ඉක්මනින් හඳුනාගත හැකිය.

■ DNA මකනයට ඉක්මනින් මුදා හරින ලද ජෙනෝම ඉවත් කළ හැකි අතර, පසුකාලීන පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල මත ඇති වන බලපෑම බෙහෙවින් අඩු කරයි.

■ ප්‍රශස්ත RT සහ qPCR පද්ධතිය මඟින් පියවර දෙකේ RT-PCR ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම වඩාත් කාර්යක්ෂම සහ PCR වඩාත් නිශ්චිත වන අතර RT-qPCR ප්‍රතික්‍රියා නිෂේධකවලට වඩා ප්‍රතිරෝධී කරයි.

කට්ටල යෙදුම

යෙදුමේ විෂය පථය: සංස්කෘතික සෛල.

- සාම්පල ලිසිස් මගින් නිකුත් කරන ලද RNA: මෙම කට්ටලයේ RT-qPCR අච්චුවට පමණක් අදාළ වේ.

- කට්ටලය පහත සඳහන් අරමුණු සඳහා භාවිතා කළ හැක: ජාන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය, siRNA-මැදිහත් වූ ජාන නිශ්ශබ්ද කිරීමේ බලපෑම තහවුරු කිරීම, මත්ද්‍රව්‍ය පරීක්‍ෂා කිරීම යනාදිය.

රූප සටහන

ගබඩා කිරීම සහ කල් තබා ගැනීම

මෙම කට්ටලයේ I කොටස 4℃ හි ගබඩා කළ යුතුය;II කොටස -20℃ ගබඩා කළ යුතුය.

Foregene Protease Plus II 4℃ දී ගබඩා කළ යුතුය, -20℃ හි කැටි නොකරන්න.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR අඳුරේ -20℃ ගබඩා කළ යුතුය;නිතර භාවිතා කරන්නේ නම්, එය කෙටි කාලීන ගබඩා කිරීම සඳහා 4℃ ගබඩා කළ හැක (දින 10 ක් ඇතුළත භාවිතා කරන්න). අපි පළපුරුදු නිෂ්පාදකයෙක් වී ඇත.Wining the major in the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, ගුණාත්මකභාවය කර්මාන්තශාලාවේ ජීවිතය , පාරිභෝගික ඉල්ලුම මත අවධානය යොමු කරන්න සමාගම පැවැත්ම සහ සංවර්ධනය පිළිබඳ මූලාශ්‍රය, We adhere to honesty and good faith working attitude, looking forward to your coming !
විශාල වට්ටමක්China Taq DNA පොලිමරේස්, Qpcr, අපගේ සමාගම පොරොන්දු වේ: සාධාරණ මිල ගණන්, කෙටි නිෂ්පාදන කාලය සහ තෘප්තිමත් අලෙවියෙන් පසු සේවාව, ඔබට අවශ්‍ය ඕනෑම වේලාවක අපගේ කර්මාන්ත ශාලාව නැරඹීමට අපි ඔබව සාදරයෙන් පිළිගනිමු.දැන් අපි එකට ප්‍රසන්න හා දිගුකාලීන ව්‍යාපාරයක් කිරීමට ප්‍රාර්ථනා කරමු!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

සෛල සෘජු RT-qPCR සඳහා ≤ 1000,000 සෛල භාවිතා කරයි

නිෂ්පාදන හැඳින්වීම

මෙම නිෂ්පාදනය RT-qPCR ප්‍රතික්‍රියා සඳහා සංස්කෘත සෛල සාම්පල වලින් RNA ඉක්මනින් මුදා හැරීමට අද්විතීය ලයිසිස් බෆර පද්ධතියක් භාවිතා කරයි, කාලය ගතවන සහ වෙහෙසකාරී RNA පිරිසිදු කිරීමේ ක්‍රියාවලිය ඉවත් කරයි, සහ අවශ්‍ය RNA අච්චුව ලබා ගැනීමට මිනිත්තු 7 ක් පමණි, 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR මිශ්‍රණය සමඟින්, 2× Direct qPCR මිශ්‍රණය-ටක්මන් ඉක්මනින් ලබා ගත හැක.

5× Direct RT Mix සහ 2× Direct qPCR Mix-Taqman ශක්තිමත් නිෂේධක ඉවසීමක් ඇති අතර අච්චුවක් ලෙස මැනිය යුතු නියැදියේ ලයිසේට් භාවිතයෙන් කාර්යක්ෂම ප්‍රතිවර්තනය සහ නිශ්චිත විස්තාරණය සිදු කළ හැකිය.ප්‍රතික්‍රියාකාරකයේ Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl අඩංගු වේ.₂, ප්‍රතික්‍රියා බෆරය, PCR Optimizer සහ Stabilizer, ලයිසිස් බෆරය සමඟින් ඉක්මනින් සහ පහසුවෙන් සාම්පල හඳුනා ගැනීමට භාවිත කළ හැකි අතර ඉහළ සංවේදීතාව, නිශ්චිතභාවය සහ ස්ථායීතාවයේ ලක්ෂණ ඇත.

නිෂ්පාදන විශේෂාංග

RNA සාම්පල ලබා ගැනීමට මිනිත්තු 7ක් වැනි සුළු කාලයක් ගතවන සරල, ඵලදායී Cell Direct RT තාක්ෂණය.

නියැදි අවශ්‍යතා කුඩා වන අතර, අත්හදා බැලීම සඳහා අවම වශයෙන් සංස්කෘතික සෛල 10ක් භාවිතා කළ හැක.

384, 96, 24, 12, සහ 6-ළිං තහඩු වැනි සංස්කෘතික සෛල වේගවත් RNA අත්පත් කර ගැනීම සඳහා ඉහළ ප්‍රතිදානය.

DNA මකනයට ඉක්මනින් මුදා හරින ලද ජෙනෝම ඉවත් කිරීමට හැකි වන අතර, පසුකාලීන පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵල මත ඇති වන බලපෑම බෙහෙවින් අඩු කරයි.

ප්‍රශස්ත RT සහ qPCR පද්ධති වඩාත් කාර්යක්ෂම ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම, විශේෂත්වය සහ ශක්තිමත් RT-qPCR ප්‍රතික්‍රියා නිෂේධක ඉවසීම සහිත පියවර දෙකක RT-PCR සක්‍රීය කරයි.

කට්ටල යෙදුම

යෙදුමේ විෂය පථය: සංස්කෘතික සෛල.

නියැදි ලයිසිස් අර්ථකථනය කරන ලද RNA: භාවිතා කරනුයේ ද්වි-පියවර RT-qPCR අච්චුවක් ලෙස පමණි.

පහත සඳහන් අරමුණු සඳහා කට්ටල භාවිතා කළ හැක: ජාන නියාමන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය, ඇලිලේ පරීක්ෂාව, ඖෂධ පරීක්ෂාව, ආදිය.

කට්ටල සීමාවන්

වර්ධක කොටස් ≤ 300 bp.

සෛල නැවුම් ලෙස වගා කිරීම සඳහා කට්ටල භාවිතා වේ.

නිෂ්පාදන තත්ත්ව පාලනය

FOREGENE හි සම්පූර්ණ තත්ත්ව කළමනාකරණ පද්ධතියට අනුව, Cell Direct RT-qPCR ශ්‍රේණි කට්ටලවල සෑම කාණ්ඩයක්ම කිහිප වතාවක්ම දැඩි ලෙස පරීක්‍ෂා කරනු ලබන්නේ එක් එක් කට්ටලවල ගුණාත්මක භාවයේ විශ්වසනීයත්වය සහ ස්ථාවරත්වය සහතික කිරීම සඳහාය.

කට්ටලයේ අන්තර්ගතය

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman වෙන වෙනම මිලට ගත හැක, විස්තර උපග්‍රන්ථය 1 (PAGE 13) හි දක්වා ඇත.

ගබඩා කොන්දේසි

1. නැව්ගත කිරීමේ කොන්දේසි

කට්ටලය <4 °C තත්ත්‍වයේ ඇති බව සහතික කිරීම සඳහා අඩු උෂ්ණත්ව අයිස් ඇසුරුම් පෙට්ටි ප්‍රවාහනයේ සම්පූර්ණ ක්‍රියාවලිය.

2. ගබඩා කොන්දේසි

I කොටස 4 ° C සහ II කොටස -20 ° C දී ගබඩා කරන්න.

Foregene Protease Plus II 4 ° C දී ගබඩා කළ යුතුය, -20 ° C දී ශීත කළ නොවේ.

ප්‍රතික්‍රියාකාරක 2× Direct qPCR Mix-Taqman -20°C, හෝ නිතර භාවිතා කරන්නේ නම් (දින 10ක් ඇතුළත) කෙටි කාලීන භාවිතය සඳහා 4°C දී ගබඩා කෙරේ.

කට්ටල සංරචක තොරතුරු

බෆර් CL: සෛල ලයිසිස් ප්‍රතික්‍රියා සඳහා අවශ්‍ය පරිසරය සපයයි.

බෆර් ST: පසුකාලීන RT වලට බලපෑම් වළක්වා ගැනීම සඳහා ලයිසේට් හි ක්‍රියාකාරී ද්‍රව්‍යය අවසන් කරයි.

DNA මකනය: DNA ඉවත් කරන්නා, පසුකාලීන අත්හදා බැලීම් මත ජෙනෝමය ඉවත් කිරීමේ බලපෑම.

5× සෘජු RT මිශ්‍රණය: ප්‍රශස්ත පෙළගැස්ම සඳහා ඉහළ RNA සම්බන්ධතා Foregene Reverse Transscriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, ස්ථායීකාරක, වැඩි දියුණු කරන්නන්, ප්‍රශස්තකාරක සහ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රයිමර් අඩංගු වේ (Random Primer, Oligo(dT)₁₈ප්‍රයිමර්).

Foregene Protease Plus II: ලිසිස් බෆරයේ සන්දර්භය තුළ, සෛල න්යෂ්ටික අම්ල මුදා හැරීම සඳහා ලයිස් කරනු ලැබේ.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: මෙම ප්‍රතික්‍රියාකාරකයේ Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl අඩංගු වේ.₂, ප්‍රතික්‍රියා බෆරය, PCR ප්‍රශස්තකරණය, සහ ස්ථායීකාරකය.

20× ROX Reference Dye: සාමාන්‍යයෙන් ABI, Stratagene සහ වෙනත් සමාගම්වල Real Time PCR විස්තාරණ උපකරණවල භාවිතා වේ, එය PCR මාත්‍රා දෝෂ නිසා ඇතිවන PCR නල සහ නල අතර වෙනස සකස් කිරීමට භාවිතා කරයි.විවිධ උපකරණ සඳහා අවශ්‍ය 20× ROX Reference Dye සාන්ද්‍රණය වෙනස් වන අතර, භාවිතා කරන්නාට උපකරණයේ නිර්දේශිත සාන්ද්‍රණය අනුව එය එක් කළ හැක.

RNase-Free ddH₂O: පියවර දෙකක RT-qPCR ප්‍රතික්‍රියා සඳහා RNase-නිදහස් විෂබීජහරණය කළ අතිශය පිරිසිදු ජලය.

පූර්වාරක්‍ෂා:(කට්ටලය භාවිතා කිරීමට පෙර පූර්වාරක්ෂාවන් ප්රවේශමෙන් කියවීමට වග බලා ගන්න)

සාම්පල අතර හරස් දූෂණය වළක්වා ගැනීම සඳහා අත්හදා බැලීමේ මෙහෙයුම් ක්‍රමයට අවධානය යොමු කරන්න.

RNase දූෂණය සහ RNA ක්ෂය වීම වළක්වා ගැනීම සඳහා පර්යේෂණාත්මක පරිසරයේ සහ උපකරණවල පිරිසිදුකම කෙරෙහි අවධානය යොමු කරන්න.

නැවුම් හෝ හොඳින් සංරක්ෂණය කරන ලද සෛල සාම්පල ගන්න සහ නැවත නැවත ශීත කළ-දියවන ලද සෛල සාම්පල භාවිතා නොකරන්න.

5× සෘජු qPCR මිශ්‍රණය,2× සෘජු qPCR මිශ්‍රණය-ටක්මන් නැවත නැවත කැටි කිරීම වැළැක්විය යුතුය, එසේ නොමැතිනම් එය ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමට සහ PCR කාර්යක්ෂමතාවයට බලපානු ඇත.

සූදානම් කරන්නසලාකකලින්මෙහෙයුම්

මෙම කට්ටලය භාවිතා කිරීමට පෙර උපදෙස් හොඳින් කියවීමට වග බලා ගන්න.Cell Direct RT-qPCR කට්ටලය ක්‍රියාත්මක කිරීමට සරල, පහසු සහ වේගවත් වන අතර උපදෙස් මඟින් සම්පූර්ණ කට්ටලය සහ එය නිවැරදිව භාවිතා කරන ආකාරය පිළිබඳ සම්පූර්ණ තොරතුරු සපයයි.කරුණාකර භාවිතයට පෙර අවශ්ය පර්යේෂණාත්මක ද්රව්ය සහ උපකරණ සකස් කරන්න.

පර්යේෂණාත්මක ද්රව්ය සහ උපකරණ

◆ සංස්කෘතික සෛල.

◆ 1.5 ml හෝ 2 ml, RNase-/DNase-නිදහස් කේන්ද්රාපසාරී නළය, RNase-/DNase-නිදහස් ඉඟිය, 0.2 ml වඳ qPCR නළය.

◆ qPCR යන්ත්‍රය, පයිප්ප, මේස මුදුනේ කේන්ද්‍රාපසාරී (≥13,400 කි×g) (පර්යේෂණාත්මක අවශ්යතා මත පදනම්ව) ආදිය.

ආරක්ෂාව

◆ මෙම නිෂ්පාදනය විද්‍යාත්මක පර්යේෂණ අරමුණු සඳහා පමණි, කරුණාකර එය ඖෂධ, සායනික, ආහාර සහ රූපලාවන්‍ය අරමුණු සඳහා භාවිතා නොකරන්න.

◆ රසායන ද්‍රව්‍ය භාවිතා කරන විට සුදුසු රසායනාගාර ඇඳුම්, අත්වැසුම්, ආරක්ෂිත වීදුරු ආදිය පළඳින්න.

මෙහෙයුම්මාර්ගෝපදේශකයින්

Cell Lysis පද්ධති, RT පද්ධති, සහ qPCR ප්‍රතික්‍රියා විසඳුම් අතිරේක ඇසුරුම් වෙන වෙනම මිලදී ගත හැක, උපග්‍රන්ථය 1 (PAGE 13) හි විස්තර සඳහා.

මෙහෙයුම් මාර්ගෝපදේශය

A: සාම්පල RNA නිකුතුව

1. සෛල පූර්ව ප්‍රතිකාර කරන ලදී: සීතල PBS සමඟ සෛල සංස්කෘතික තහඩුව සෝදන්න, ඉන්පසු සෛල ලයිස් කරන්න (10-10⁶), 10⁶ සෛල ප්‍රමාණයට වඩා, RNA නිස්සාරණය සහ පිරිසිදු කිරීම සඳහා Foregene the Cell සහ RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) හෝ Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) නිර්දේශ කෙරේ.

1.1අනුබද්ධ සෛල (24- ළිං තහඩුව උදාහරණයක් ලෙස)

1.1.1.එක් එක් ළිඳෙහි ඇති සෛල ගණන තීරණය කරන්න, සෛල ගණන 1 × 10 බව තීරණය කරන්න⁵, සහ සංස්කෘතික පිඟානෙන් සංස්කෘතික මාධ්යය ඉවත් කිරීමට පයිප්පයක් භාවිතා කරන්න.

1.1.2සෑම ළිඳකටම පෙර ශීත කළ 1 × PBS 200 μl එකතු කරන්න.නැවත නැවත නල නොයන්න සහ ළිං වලින් PBS ඉවත් කරන්න.තහඩුව ඇල කර හැකි තරම් PBS ඉවත් කරන්න.පියවර 2 වෙත යන්න.

1.1.3සෛල සේදීම සඳහා පෙර සිසිලනය කළ 1 × PBS එකතු කරන ලද විවිධ සෛල සංස්කෘතික කෑමක් හෝ යොමු අංක 1-1 වගුවක් සෛල සංස්කෘතික කෑමක් තුළ එකතු කරන ලදී.

වගුව 1-1: විවිධ සෛල සංඛ්‍යා සඳහා PBS මාත්‍රාව

සටහන：ස්ථිර අනුගත සෛල සහතික කිරීම සඳහා,සේදීමේදී සෛල විශාල සංඛ්යාවක් අහිමි වීම වළක්වා ඇත.

1.2සිදුරු රහිත තහඩු වල වගා කරන ලද අත්හිටුවන ලද සෛල හෝ අනුබද්ධ සෛල

1.2.1බහු-නොවන ළිං තහඩු වල වගා කරන ලද ඇලවුම් සෛල (අත්හිටුවීමේ සෛල ඊළඟ පියවර 1.2.2 සිට ආරම්භ වේ), සාමාන්‍ය සෛල එකතු කිරීමේ ක්‍රමයට අනුව සෛල එකතු කර වෙන් කර සංස්කෘතික තහඩුවක හෝ කේන්ද්‍රාපසාරී නලයක තබන්න;ට්‍රයිප්සිනීකරණය භාවිතා කරන්නේ නම්, සෛල එකතු කිරීමට සහ අවශේෂ ට්‍රයිප්සින් ඉවත් කිරීමට කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීම අවශ්‍ය වේ, සෛල විසුරුවා හැරීම සඳහා PBS නැවත සකස් කළ සෛල එක් එක් සෛල තුළට එක් කළේය.

1.2.2ගණනය කරන ලද සෛල ගණනට පසුව, ඇල්කෝටඩ් සෛල 1×10⁵ එක් සිට කේන්ද්රාපසාරී නල, විනාඩි 10 ක් සඳහා 1000 × g දී කේන්ද්රාපසාරී මගින් සෛල එකතු කරන්න.

1.2.3කේන්ද්‍රාපසාරී නලයට 200 μl PBS එක් කරන්න, නැවත නැවත නල නොයන්න, සහ PBS සෘජුවම උරාගන්න.පියවර 2 වෙත යන්න. (අවශ්‍යනය කිරීමට අපහසු නම් සහ සෛල නැවත ලබා දුන්නේ නම්, අධි ප්‍රවාහය ඉවතලීමෙන් විනාඩි 10 කට පසු 1000×g කේන්ද්‍රාපසාරී සිදු කළ හැක, සෛල පෙති 2 පියවරට යයි)

2.Cell lysis: Buffer CL ඉවත් කරන්න, කාමර උෂ්ණත්වයට සමතුලිත එහි උෂ්ණත්වය, DNA මකනය සහ Foregene Protease Plus II, පහත වගුවේ 1-2 සකස් කළ ලිසිස් පද්ධතියට අනුව: (Lysis විසඳුම භාවිතයට සූදානම්).

වගුව 1-2: කැඩීම පද්ධතිය සකස් කිරීම (සටහන: අයිස් මත සකස් කිරීමේදී)

3.(උදාහරණයක් ලෙස 24-ළිං තහඩුව ) Pipette 200 μl සෛල ලයිසිස් මාස්ටර් එක් එක් ළිඳට මිශ්‍ර කරන්න, නැවත නැවතත් 5-10 වාරයක් පිඹින්න, කාමර උෂ්ණත්වයේ (20-25 ℃) විනාඩි 5 ක් පුර්ව තනන්න.

සටහන：බුබුලු ඇතිවීම වැලැක්වීම සඳහා, කරුණාකර පයිපට් පරිමාණය 200μl හෝ ඊට අඩු ලෙස සකස් කරන ලදී.ලයිසිස් පසු සෛල වලාකුළු සහිත විය හැක, එය සාමාන්ය වේ.

4.(උදාහරණයක් ලෙස 24 –ළිං තහඩුව ) දියර 20 μl බෆර් එස්ටී (විවිධ ලයිසිස් පද්ධති බෆර ST වගුව 1-3 හි දක්වා ඇති ප්‍රමාණයකින් එකතු කර ඇත), කාමර උෂ්ණත්වයේ දී (20-25 ℃) 5-10 වාරයක් නැවත නැවත නල කිරීම විනාඩි 2 ක් සඳහා පුර්වාංගීකරණය කරන ලදී.

සටහන：පයිපෙට් තුඩය මතුපිටට පහළින් බැහැර කර, ලයිසේට් එකතු කර ඇති බව සහතික කරයි,බුබුලු ඇතිවීම වැලැක්වීම සඳහා, කරුණාකර පයිපට් පරිමාණය 200μl හෝ ඊට අඩු ලෙස සකස් කරන ලදී.

වගුව 1-3：බෆර් ST එකතු කරන්න

5. ලයිසේට් පසුකාලීන RT-qPCR පරීක්ෂණ සඳහා භාවිතා වේ.පසුකාලීන අත්හදා බැලීම් නියමිත වේලාවට සිදු කළ නොහැකි නම්, කරුණාකර එය පැය 2 කට වඩා වැඩි කාලයක් අයිස් මත තබා -20℃ හෝ -80 ℃ (මාස තුනකට වඩා වැඩි නොවේ) ගබඩා කරන්න.

B: RT පද්ධතිය සකස් කිරීම

1. 5 × සෘජු RT මිශ්‍රණය පිටතට ගෙන අයිස් ස්නානයක තබන්න, එය ස්වභාවිකව දිය වීමට ඉඩ හරින්න, පසුව භාවිතය සඳහා මෘදු ලෙස මිශ්‍ර කරන්න;RNase-Free ddH2O පිටතට ගෙන එය උණු කර පසුව භාවිතය සඳහා අයිස් ස්නානයක තබන්න.පහත වගුව 2-1 අනුව අයිස් මත ප්රතික්රියා පද්ධතිය සකස් කරන්න.

වගුව 2-1: RT ප්රතික්රියා පද්ධතිය සකස් කිරීම

2.පද්ධති සැකසීම අවසන් වූ පසු, පහත වගුවේ 2 -2 ප්‍රතික්‍රියා තත්ව RT ප්‍රතික්‍රියාවේ කෙටියෙන් මෘදු මිශ්‍ර කර කේන්ද්‍රාපසාරී කර ඇත.

වගුව 2-2: RT ප්රතික්රියා තත්ත්වය සැකසීම

3.ප්‍රතික්‍රියාව අවසන් වූ පසු, ප්‍රතික්‍රියා නිෂ්පාදනය qPCR සඳහා සෘජුවම අයිස් මත තබන ලදී, කරුණාකර දිගුකාලීන සංරක්ෂණය -20℃ හෝ -80 ℃ .

සටහන: පිරිසිදු නොකළ අච්චුව භාවිතය හේතුවෙන්, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ නිෂ්පාදනයේ සුදු අවක්ෂේප දිස්විය හැක.මෙය සාමාන්‍ය සංසිද්ධියකි.පසුකාලීන අත්හදා බැලීම් සඳහා වහාම අධි ප්‍රවාහය කේන්ද්‍රාපසාරී කරන්න.

ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබෙන RT ප්‍රතික්‍රියා විසඳුම මීළඟ පියවර තත්‍ය කාලීන PCR ප්‍රතික්‍රියා පද්ධති වෙත එකතු කරනු ලැබේ, ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියේ 10-30% දක්වා ප්‍රමාණ එකතු කිරීම නිර්දේශ කෙරේ.

C: qPCR ප්රතික්රියා පද්ධතිය සකස් කිරීම

1.ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියක් සකස් කිරීම සඳහා පහත වගුවේ 3-1 අනුව පියවර cDNA සැකිල්ලෙන් සකස් කරන ලද B හි සුදුසු ප්‍රමාණය.

සටහන: cDNA සැකිල්ලේ ප්‍රමාණය qPCR පද්ධතියෙන් 10-30%ක් වේ.උදාහරණයක් ලෙස, 20μl qPCR පද්ධතියක, 2-6 μl lysis buffer එක් කරන්න, නමුත් 6 μl ට වඩා වැඩි නොවේ.

2. qPCR ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා ප්‍රශස්තකරණය යහපත් qPCR තත්ත්ව (උෂ්ණත්වයේ උෂ්ණත්වය, ආදිය) (වගුව 3-2 හි දක්වා ඇති ප්‍රතික්‍රියා කොන්දේසි).

සටහන: වඩා හොඳ ප්‍රතිඵල ලබා ගැනීම සඳහා qPCR ප්‍රතික්‍රියා සඳහා ප්‍රශස්ත තත්ත්වයන් භාවිතා කිරීමට උත්සාහ කරන්න.

වගුව 3-1: PCR ප්රතික්රියා පද්ධතිය සකස් කිරීම

1*: ප්‍රයිමර් ප්‍රතික්‍රියා කාර්ය සාධනය දුර්වල වූ විට ප්‍රාථමික සාන්ද්‍රණය 50-900 nM පරාසයක සකස් කළ හැක.

සටහන: qPCR පද්ධතිය පර්යේෂණාත්මක අවශ්‍යතා සහ ප්‍රතිදීප්ත බයිසිකල් ආකෘතිය අනුව සකස් කළ හැක.50 දී qPCR සඳහාμl පද්ධතිය, ප්‍රතික්‍රියාකාරක මාත්‍රාව 20 ට අනුව සමානුපාතිකව සකසන්නμl පද්ධතිය.

2*: ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක තාප චක්‍රය අනුව ROX Reference Dye හි සුදුසු අවසාන සාන්ද්‍රණය තෝරන්න.සාමාන්‍ය ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක සයිකල් සඳහා වඩාත් සුදුසු ROX සමුද්දේශ ඩයි සාන්ද්‍රණය පහත වගුවේ දක්වා ඇත:

වගුව 3-2: qPCR ප්රතික්රියා කොන්දේසි සපයනු ලැබේ

සටහන: හොඳම qPCR ආචරණය ලබා ගැනීම සඳහා, විවිධ සැකිලි සහ විවිධ ප්‍රයිමර් සඳහා ප්‍රතික්‍රියා තත්ත්වයන් ප්‍රශස්ත කිරීමට ශ්‍රේණි PCR භාවිතා කළ හැක.PCR ප්‍රතික්‍රියා තත්ත්‍වයන් ප්‍රතිදීප්ත විශ්ලේෂකය, අච්චුව, ප්‍රාථමිකය, යනාදිය මත පදනම්ව වෙනස් වේ. නිශ්චිත මෙහෙයුමේදී, ප්‍රශස්ත ප්‍රතික්‍රියා තත්ත්වයන් සැලසුම් කළ යුත්තේ ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක තාප චක්‍රය, අච්චු වර්ගය, උනන්දුව ඛණ්ඩනයේ ප්‍රමාණය, විස්තාරණය කරන ලද ඛණ්ඩනයේ පාදක අනුපිළිවෙල සහ GC ප්‍රතික්‍රියා කාලය, උෂ්ණත්වය, ප්‍රථමික කාලය, ඇතුළුව ප්‍රශස්ත ප්‍රතික්‍රියා තත්ත්වයන් ය.

රියල් ටයිම් PCR ප්‍රයිමර් සැලසුම් මූලධර්ම

Forward Primer සහ Reverse Primer

රියල් ටයිම් PCR සඳහා, ප්‍රාථමික නිර්මාණය ඉතා වැදගත් වේ.ප්‍රයිමර් PCR විස්තාරණයේ විශේෂත්වය සහ කාර්යක්ෂමතාවයට සම්බන්ධ වන අතර පහත සඳහන් මූලධර්මවලට අදාළව නිර්මාණය කළ හැක:

◆ ප්‍රාථමික දිග: 18-30bp.

◆ GC අන්තර්ගතය: 40-60%.

◆ Tm අගය: Primer 5 වැනි ප්‍රයිමර් නිර්මාණ මෘදුකාංග වලට ප්‍රයිමරයේ Tm අගය ලබා දිය හැක.ඉහළ සහ පහළ ප්‍රාථමික වල Tm අගයන් හැකි තරම් සමීප විය යුතුය.Tm ගණනය කිරීමේ සූත්‍රය ද භාවිතා කළ හැක: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR සිදු කරන විට, ප්‍රාථමික Tm අගය 5 °C ට වඩා අඩු උෂ්ණත්වයක් සාමාන්‍යයෙන් annealing උෂ්ණත්වය ලෙස තෝරා ගනු ලැබේ (නිවාරණ උෂ්ණත්වයේ අනුරූප වැඩි වීම PCR ප්‍රතික්‍රියාවේ විශේෂත්වය වැඩි කළ හැක).

◆ ප්‍රයිමර් සහ PCR නිෂ්පාදන:

◆ සැලසුම් ප්‍රයිමර් PCR විස්තාරණ නිෂ්පාදන දිග 100-150bp වේ.

◆ අච්චුවේ ද්විතියික ව්‍යුහාත්මක ප්‍රදේශයේ සැලසුම් ප්‍රයිමර් හැකිතාක් වැළැක්විය යුතුය.

◆ ඉහළ සහ පහළ ප්‍රයිමර් වල 3′ අන්ත අතර අනුපූරක පාද 2ක් හෝ වැඩි ගණනක් සෑදීමෙන් වළකින්න.

◆ ප්‍රයිමර් 3′ පර්යන්ත පාදය අතිරේක අඛණ්ඩ G හෝ C 3ක් සමඟ තිබිය නොහැක.

◆ ප්‍රයිමර් වලටම අනුපූරක ව්‍යුහයන් තිබිය නොහැක, එසේ නොවුවහොත් PCR විස්තාරණයට බලපාන කෙස් කටු ව්‍යුහයක් සාදනු ඇත.

◆ ATCG ප්‍රාථමික අනුපිළිවෙලෙහි හැකිතාක් ඒකාකාරව බෙදා හැරිය යුතු අතර, 3′ පර්යන්ත පාදය T ලෙස වැළැක්විය යුතුය.

උපග්රන්ථය1：Cell සෘජුRT-qPCR කට්ටලයt අතිරේක ඇසුරුම

1.සෛල ලිසිස් විසඳුම