1. මූලික අවබෝධය
මෙම අවස්ථාවෙහිදී, අපගේ ජ්‍යෙෂ්ඨයන් ඉදිරියේ වැරදි සිදු නොකිරීමට, අපි සමහර සංකල්ප සහ පාරිභාෂිතය තේරුම් ගත යුතුය, එනම්:
ප්‍ර: RT-PCR, qPCR, Real-time PCR සහ real-time RT-PCR අතර වෙනස කුමක්ද?
පිළිතුර: RT-PCR යනු ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ PCR වේ(ප්රතිලෝම පරිවර්තන PCR, RT-PCR), එය බහුලව භාවිතා වන පොලිමරේස් දාම ප්රතික්රියාවේ (PCR) ප්‍රභේදයකි.RT-PCR හි, RNA නූල් අනුපූරක DNA බවට ප්රතිලෝම පිටපත් කරනු ලැබේ, පසුව එය PCR මගින් DNA විස්තාරණය සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරයි.
තත්‍ය කාලීන-PCR සහ qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) යනු එකම දෙයකි, දෙකම තත්‍ය කාලීන ප්රමාණාත්මක PCR වේ, එයින් අදහස් වන්නේ PCR හි සෑම චක්‍රයකම තත්‍ය කාලීන දත්ත වාර්තා ඇති බවයි, එබැවින් ආරම්භක සැකිලි ගණන නිශ්චිත විශ්ලේෂණයක් සකස් කළ හැකිය.
Real-time PCR (real-time fluorescent quantitative PCR) සහ Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) යන දෙකම RT-PCR ලෙස කෙටියෙන් දක්වා ඇති බවක් පෙනුනද, ජාත්‍යන්තර සම්මුතිය නම්: RT-PCR විශේෂයෙන් ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා යොමු කරයි.PCR , Real-time PCR සාමාන්යයෙන් qPCR (ප්රමාණාත්මක තත්‍ය කාලීන PCR) ලෙස කෙටි වේ..
සහ තත්‍ය කාලීන RT-PCR (RT-qPCR), එය ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක තාක්ෂණය සමඟ ඒකාබද්ධ වූ ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ PCR වේ.: ප්‍රථමයෙන් RNA ප්රතිලෝම පිටපතෙන් cDNA (RT) ලබා ගන්න, ඉන්පසු ප්රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය (qPCR) සඳහා තත්‍ය කාලීන PCR භාවිතා කරන්න.බොහෝ රසායනාගාර RT-qPCR, එනම්, RNA ප්‍රකාශනය අඩු-නියාමනය පිළිබඳ පර්යේෂණ සිදු කරයි, එබැවින් රසායනාගාරයේ සෑම කෙනෙකුම කතා කරන qPCR ඇත්ත වශයෙන්ම RT-qPCR වෙත යොමු කරයි, නමුත් සායනික යෙදුම්වල තවමත් බොහෝ DNA පරීක්ෂණ ඇති බව අමතක නොකරන්න.හෙපටයිටිස් බී වෛරස් HBV හඳුනාගැනීම වැනි ප්රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය.
ප්‍රශ්නය: ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR විශාල ප්‍රමාණයක් කියවීමෙන් පසු, විස්තාරණය කරන ලද කොටස 80-300bp පරාසය තුළ පාලනය කළ යුත්තේ ඇයි?
පිළිතුර: එක් එක් ජාන අනුපිළිවෙලෙහි දිග වෙනස් වේ, සමහරක් kb කිහිපයක්, සමහරක් bp සිය ගණනක්, නමුත් අපට අවශ්ය වන්නේ ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීමේදී නිෂ්පාදන දිග 80-300bp වීම පමණි, ඉතා කෙටි හෝ දිගු ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR හඳුනාගැනීම සඳහා සුදුසු නොවේ.නිෂ්පාදන ඛණ්ඩය ප්‍රයිමර්-ඩිමර් වලින් වෙන්කර හඳුනාගත නොහැකි තරම් කෙටි ය.ප්‍රයිමර්-ඩිමර් වල දිග 30-40bp පමණ වන අතර එය 80bp ට වඩා අඩු නම් එය ප්‍රයිමර්-ඩිමර් හෝ නිෂ්පාදනයක් ද යන්න වෙන්කර හඳුනා ගැනීම අපහසුය.නිෂ්පාදන ඛණ්ඩය ඉතා දිගු නම්, 300bp ඉක්මවන්නේ නම්, එය පහසුවෙන් අඩු විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයකට තුඩු දෙනු ඇති අතර ජානයේ ප්රමාණය ඵලදායී ලෙස හඳුනාගත නොහැක.
නිදසුනක් වශයෙන්, ඔබ පන්ති කාමරයක කොපමණ පිරිසක් සිටිනවාද යන්න ගණනය කරන විට, ඔබ ගණන් කළ යුත්තේ කට කීයක් තිබේද යන්න පමණි.ඔබ ජාන හඳුනා ගන්නා විටද එයම සත්‍ය වේ, ඔබට අවශ්ය වන්නේ යම් ජානයක අනුපිළිවෙලක් නිරූපනය කිරීම සඳහා සම්පූර්ණ අනුපිළිවෙලම සිදු කරනු ඇත.ඔබට මිනිසුන් ගණන් කිරීමට අවශ්ය නම්, ඔබට මුඛය සහ නාසය, කන් සහ වීදුරු යන දෙකම ගණන් කළ යුතු අතර, එය වැරදි කිරීමට පහසුය.
පුළුල් කිරීමට, ජීව විද්යාත්මක පර්යේෂණවලදී, ලක්ෂයෙන් ප්‍රදේශයට පර්යේෂණ අවස්ථා රාශියක් ඇත, මන්ද ඕනෑම විශේෂයක ජාන අනුක්‍රමය ඉතා දිගු බැවින්, බැක්ටීරියා 16S අනුක්‍රමය වැනි සියලුම කොටස් මැනිය නොහැකි හා අනවශ්‍ය හා කළ නොහැකි ය, එනම් බැක්ටීරියා වල කොන්සර්වේටිව් අනුක්‍රමය ක්‍රියාත්මක කිරීම සඳහා යම් බැක්ටීරියා ජනගහණයක් අනුමාන කිරීම සඳහා Assays.
Q: qPCR ප්‍රයිමර් නිර්මාණය සඳහා ප්‍රශස්ත දිග කුමක්ද?
පිළිතුර: සාමාන්යයෙන් කථා කිරීම, ප්රාථමික දිග 20-24bp පමණ වේ, එය වඩා හොඳය.ඇත්ත වශයෙන්ම, ප්‍රාථමිකය සැලසුම් කිරීමේදී අපි ප්‍රාථමිකයේ ටීඑම් අගය කෙරෙහි අවධානය යොමු කළ යුතුය, මන්ද මෙය ප්‍රශස්ත නිර්වින්දන උෂ්ණත්වයට සම්බන්ධ වේ.බොහෝ අත්හදා බැලීම් වලින් පසුව, 60 ° C වඩා හොඳ TM අගයක් බව ඔප්පු වී ඇත.නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය ඉතා අඩු නම්, එය පහසුවෙන් විශේෂිත නොවන විස්තාරණයකට තුඩු දෙනු ඇත.නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය ඉතා ඉහළ නම්, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සාපේක්ෂව අඩු වනු ඇත, වර්ධක වක්‍රයේ උච්චය පසුව ආරම්භ වනු ඇත, සහ CT අගය ප්‍රමාද වනු ඇත.
ප්‍ර: සායම් ක්රමය පරීක්ෂණ ක්‍රමයට වඩා වෙනස් වන්නේ කෙසේද?
පිළිතුර: ඩයි ක්රමයSYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO යනාදී සමහර ප්රතිදීප්ත සායම් තමන් විසින්ම ආලෝකය විමෝචනය නොකරන නමුත් ද්විත්ව නූල් සහිත DNA වල කුඩා වලකට බැඳීමෙන් පසු ප්රතිදීප්ත විමෝචනය කරයි.එබැවින්, PCR ප්රතික්රියාවේ ආරම්භයේ දී, යන්ත්රය ප්රතිදීප්ත සංඥාව හඳුනාගත නොහැකිය.ප්‍රතික්‍රියාව annealing-extension අදියරට ළඟා වූ විට, ද්විත්ව කෙඳි විවෘත වන අතර, DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාව යටතේ නව පොටක් සංස්ලේෂණය වන අතර ප්රතිදීප්ත අණුව dsDNA කුඩා වලයට බන්ධනය වේ.PCR චක්‍ර සංඛ්‍යාව වැඩි වන විට, වැඩි වැඩියෙන් ඩයි වර්ග ද්විත්ව නූල් DNA සමඟ ඒකාබද්ධ වන අතර ප්රතිදීප්ත සංඥාව ද අඛණ්ඩව වැඩි දියුණු වේ.සායම් ක්රමය ප්රධාන වශයෙන් විද්යාත්මක පර්යේෂණ වලදී භාවිතා වේ.
PS: අත්හදා බැලීමේදී ප්‍රවේශම් වන්න, සායම් මිනිස් DNA සමඟ ඒකාබද්ධ කළ යුතුය, එය ප්රතිදීප්ත පුද්ගලයෙකු බවට පත් කිරීමට ප්‍රවේශම් වන්න.
ඩයි ක්රමය (වමේ) පරීක්ෂණ ක්රමය (දකුණ)
PS: අත්හදා බැලීමේදී ප්‍රවේශම් වන්න, සායම් මිනිස් DNA සමඟ ඒකාබද්ධ කළ යුතුය, එය ප්රතිදීප්ත පුද්ගලයෙකු බවට පත් කිරීමට ප්‍රවේශම් වන්න.
SYBR Green Ⅰ DNA වල කුඩා වලයට බන්ධනය වේ
පරීක්ෂණ ක්රමයTaqman ගවේෂණය යනු බහුලව භාවිතා වන ජල විච්ඡේදක පරීක්ෂණයයි.පරීක්ෂණයේ 5′ අන්තයේ ප්රතිදීප්ත කන්ඩායමක් ඇත, සාමාන්යයෙන් FAM, සහ විමර්ශනයම ඉලක්කගත ජානයට අනුපූරක අනුපිළිවෙලකි.3′ අන්තයේ ප්රතිදීප්ත නිවාදැමීමේ කණ්ඩායමක් ඇත.ප්රතිදීප්ත අනුනාද ශක්ති හුවමාරු මූලධර්මය අනුව (Förster resonance energy transfer, FRET), වාර්තාකරු ප්රතිදීප්ත කන්ඩායම (දානපති ප්රතිදීප්ත අණුව) සහ නිවාදැමීමේ ප්රතිදීප්ත කන්ඩායම (ප්රතිදීප්ත ප්රතිදීප්ත අණුව) උද්යෝගිමත් වන විට, වර්ණාවලි අතිච්ඡාදනය වන විට, 7 වන දුර ප්රමාණය ඉක්මවා යයි. ප්‍රතිග්‍රාහක අණුවේ ප්‍රතිදීප්තතාව, ස්වයං ප්‍රතිදීප්තතාව දුර්වල වේ.එබැවින්, PCR ප්රතික්රියාවේ ආරම්භයේ දී, පරීක්ෂණය නොමිලේ සහ පද්ධතිය තුළ නොවෙනස්ව පවතින විට, වාර්තාකරු ප්රතිදීප්ත කණ්ඩායම ප්රතිදීප්ත විමෝචනය නොකරයි.ඇනීල් කරන විට, ප්‍රයිමරය සහ ප්‍රෝබ් එක අච්චුවට බැඳේ.දිගු කිරීමේ අවධියේදී, පොලිමරේස් අඛණ්ඩව නව දාම සංස්ලේෂණය කරයි.DNA පොලිමරේස් 5′-3′ exonuclease ක්‍රියාකාරකම් ඇත.පරීක්ෂණයට ළඟා වන විට, DNA පොලිමරේස් විසින් සැකිල්ලෙන් පරීක්ෂණය ජල විච්ඡේදනය කරයි, වාර්තාකරු ප්රතිදීප්ත කණ්ඩායම නිවාදැමීමේ ප්රතිදීප්ත කාණ්ඩයෙන් වෙන් කර ප්රතිදීප්ත සංඥාව මුදා හරිනු ඇත.පරීක්ෂණය සහ අච්චුව අතර එකින් එක සම්බන්ධයක් ඇති බැවින්, පරීක්ෂණයේ නිරවද්‍යතාවය සහ සංවේදීතාව අනුව පරීක්ෂණ ක්රමය සායම් ක්‍රමයට වඩා උසස් වේ.පරීක්ෂණ ක්රමය ප්රධාන වශයෙන් රෝග විනිශ්චය කිරීමේදී භාවිතා වේ.
ප්‍ර: නිරපේක්ෂ ප්රමාණකරණය යනු කුමක්ද?සාපේක්ෂ ප්රමාණකරණය යනු කුමක්ද?
පිළිතුර: නිරපේක්ෂ ප්රමාණකරණය යනු රුධිරයේ මිලි ලීටර් 1 ක HBV වෛරස් කීයක් තිබේද යන්න වැනි qPCR විසින් පරීක්ෂා කළ යුතු සාම්පලයේ ආරම්භක පිටපත් අංකය ගණනය කිරීමයි.සාපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණයෙන් ලැබෙන ප්රතිඵලය වන්නේ වෙනත් යොමු නියැදියකට සාපේක්ෂව නිශ්චිත නියැදියක ඉලක්කගත ජාන ප්රමාණය වෙනස් වීම වන අතර ජාන ප්‍රකාශනය ඉහළ-නියාමනය හෝ පහළ-නියාමනය වේ.
ප්‍ර: RNA නිස්සාරණයේ ප්රමාණය, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව සහ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵලවලට බලපාන්නේද?
ප්‍ර: නියැදි ගබඩා කිරීම, නිස්සාරණ ප්රතික්රියාකාරක, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්රතික්රියාකාරක සහ ආලෝකය සම්ප්රේෂණය කරන පරිභෝජන ද්රව්ය පර්යේෂණාත්මක ප්‍රතිඵලවලට බලපාන්නේද?
ප්‍ර: පර්යේෂණාත්මක දත්ත නිවැරදි කළ හැකි ක්රමය කුමක්ද?
මෙම ගැටළු සම්බන්ධයෙන්, අපි ඒවා පහත උසස් සහ උසස් අංශවල විස්තරාත්මකව විස්තර කරන්නෙමු.
2. උසස් දැනුම
තත්‍ය කාලීන ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR සම්බන්ධයෙන්, සෑම වසරකම විද්යාත්මක පර්යේෂණ පත්‍රිකා දහස් ගණනක් ප්රකාශයට පත් කෙරෙන අතර, ඒ අතර ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR තාක්ෂණය කුඩා සංඛ්යාවක් නොවන බවට යථාර්ථය අප හඳුනාගත යුතුය.
ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR අත්හදා බැලීම මැනීමට පොදු ප්‍රමිතියක් නොමැති නම්, ප්රතිඵල බොහෝ සෙයින් වෙනස් විය හැක.එකම විශේෂයේ එකම ජානය සඳහා, එකම සැකසුම් ක්රමය සමඟ, හඳුනාගැනීමේ ප්රතිඵල ද බොහෝ සෙයින් වෙනස් වන අතර, ප්‍රමාද වී පැමිණෙන අයට එම ප්රතිඵල නැවත නැවත කිරීම අපහසු වනු ඇත.ඔබ හරි දේ සහ වැරදි දේ කිසිවෙකු දන්නේ නැත.
මෙයින් අදහස් කරන්නේ ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR වංචා තාක්‍ෂණයක් හෝ විශ්වාස කළ නොහැකි තාක්‍ෂණයක් බව ද?නැත, එයට හේතුව ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR වඩා සංවේදී සහ වඩාත් නිවැරදි වන අතර, කුඩා වැරදි ක්‍රියාවක් සම්පූර්ණයෙන්ම ප්රතිවිරුද්ධ ප්රතිඵල ඇති කරන බැවිනි.කුඩා පාඩුවක් සැතපුම් දහසක් දුරින්.ලිපියේ කතුවරයා සමාලෝචකයින් විසින් නැවත නැවතත් වධ හිංසාවලට ලක් විය හැකිය.ඒ අතරම, සඟරාවේ සමාලෝචකයින්ට විවිධ පර්යේෂණාත්මක ප්රතිඵල තෝරා ගැනීමට ද අපහසු වේ.
සමස්තයක් වශයෙන්, තත්‍ය කාලීන PCR අත්හදා බැලීම්වල සම්මුතියක් නොමැතිකම පෙන්වා දෙයි.මේ සඳහා කර්මාන්තයේ ජ්‍යෙෂ්ඨ විද්‍යාඥයින් ප්‍රමිතීන් සකස් කිරීමට පටන් ගත්හ.මෙම ප්‍රමිතීන් සපුරාලීම සඳහා ලිපියේ අවශ්ය පර්යේෂණාත්මක සහ දත්ත සැකසුම් විස්තර (අවශ්ය දත්ත ඇතුළුව) සැපයීමට දායකයින්ට අවශ්ය වේ.
මෙම විස්තර කියවීමෙන් සමාලෝචකයින්ට අත්හදා බැලීමේ ගුණාත්මකභාවය විනිශ්චය කළ හැකිය;අනාගත පාඨකයන්ට අත්හදා බැලීම නැවත කිරීමට හෝ අත්හදා බැලීම වැඩිදියුණු කිරීමට මෙය භාවිතා කළ හැක.එවිට මේ ආකාරයෙන් ලබාගත් පර්යේෂණාත්මක ප්රතිඵල තොරතුරු, උසස් තත්ත්වයේ සහ භාවිතා කළ හැකි වේ.
MIBBI (ජීව විද්යාත්මක සහ ජෛව වෛද්‍ය පරීක්ෂණ සඳහා අවම තොරතුරු -http://www.mibbi.org) ඇති විය.MIBBI යනු අත්හදා බැලීම් සඳහා ප්රමිති සපයන ව්‍යාපෘතියකි.එය ස්වභාව ධර්මයේ ප්රකාශයට පත් කර ඇත.මෙම ව්‍යාපෘතිය සෛල ජීව විද්‍යාව, Microarray, qPCR ඇතුළු විවිධ ජීව විද්යාත්මක අත්හදා බැලීම් සඳහා ඉලක්ක කර ඇති අතර, අපි දැන් සාකච්ඡා කිරීමට යන අතර, අත්පිටපත් ඉදිරිපත් කිරීමේදී එක් එක් වර්ගයේ අත්හදා බැලීම් සඳහා සපයයි.එම තොරතුරු සෑම විටම සැපයිය යුතුය.
MIBBI ව්‍යාපෘතියේ, ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR සම්බන්ධ ලිපි දෙකක් ඇත, එනම්:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - තත්‍ය කාලීන ප්රමාණාත්මක PCR දත්ත සඳහා ව්‍යුහගත භාෂාවක් සහ වාර්තාකරණ මාර්ගෝපදේශයක්;
·MIQE (ප්රමාණාත්මක තත්‍ය කාලීන PCR අත්හදා බැලීම් ප්‍රකාශනය සඳහා අවම තොරතුරු) - තත්‍ය කාලීන ප්රමාණාත්මක PCR අත්හදා බැලීම් පිළිබඳ ලිපි පළ කිරීම සඳහා අවම තොරතුරු.
පළමුව, පාරිභාෂිතයේ පිරිවිතරය වන RDML ගැන කතා කරමු.
සෑම දෙයක් සඳහාම සම්මත නිර්වචනයක් නොමැති නම්, සාකච්ඡාව දිගටම කරගෙන යාමට නොහැකි වනු ඇත, එම නිසා විභාගයේ දී නියමයන් පැහැදිලි කිරීම ඉතා වැදගත් වේ.
ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR අත්හදා බැලීමේදී භාවිතා කරන පාරිභාෂිතයට පහත අන්තර්ගතය ඇතුළත් වේ.QIAGEN අප වෙනුවෙන් හොඳම සාරාංශය කර ඇත.පහත සඳහන් සියල්ල වියළි යභාණ්ඩ .
විස්තාරණ වක්රය
විස්තාරණ වක්රය යනු PCR ක්‍රියාවලියේදී සාදන ලද වක්‍රයයි, චක්‍ර අංකය abscissa ලෙසත්, ප්‍රතික්‍රියාවේදී තත්‍ය කාලීන ප්රතිදීප්ත තීව්රතාවය ordinate ලෙසත් ඇත.
විශිෂ්ට විස්තාරණ වක්‍රයක පහත ලක්ෂණ තිබිය යුතුය: පාදක රේඛාව පැතලි හෝ තරමක් අඩු වී ඇති අතර, පැහැදිලි ඉහළ යාමේ ප්‍රවණතාවක් නොමැත;වක්‍රයේ ආවර්ත ලක්ෂ්‍යය පැහැදිලි වන අතර ඝාතීය අවධියේ බෑවුම විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයට සමානුපාතික වේ.බෑවුම වැඩි වන තරමට විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි වේ;සමස්ත විස්තාරණ වක්රය සමාන්තරකරණය හොඳයි, එක් එක් නලයේ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සමාන බව පෙන්නුම් කරයි;අඩු සාන්ද්‍රණ සාම්පලවල විස්තාරණ වක්‍රයේ ඝාතීය අවධිය පැහැදිලිය.
මූලික (මූලික)
මූලික පදනම වන්නේ මුල් චක්රයේ ශබ්ද මට්ටමයි, සාමාන්යයෙන් 3 වන සහ 15 වන චක්‍රය අතර මනිනු ලැබේ, මන්ද වර්ධක නිෂ්පාදනය නිසා ඇතිවන ප්රතිදීප්ත අගය වැඩි වීම මෙම කාල සීමාව තුළ හඳුනාගත නොහැකි බැවිනි.මූලික රේඛාව ගණනය කිරීමට භාවිතා කරන චක්‍ර ගණන වෙනස් විය හැකි අතර ඉහළ අච්චු ප්‍රමාණ භාවිතා කරන්නේ නම් හෝ ඉලක්කගත ජානයේ ප්‍රකාශන මට්ටම ඉහළ නම් අඩු කිරීමට අවශ්ය විය හැකිය.
මූලික රේඛාව සැකසීමට රේඛීය විස්තාරණ වක්‍රයෙන් ප්රතිදීප්ත දත්ත බැලීම අවශ්ය වේ.වර්ධක වක්‍රයේ වර්ධනය මූලික චක්රයේ ඉහළ අංකයට වඩා වැඩි චක්‍ර අංකයකින් ආරම්භ වන පරිදි මූලික රේඛාව සකසා ඇත.එක් එක් ඉලක්ක අනුපිළිවෙල සඳහා තනි තනිව පදනම් සකස් කිරීම අවශ්ය වේ.මුල් චක්‍රවල හඳුනාගත් සාමාන්ය ප්රතිදීප්ත අගයන් විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදනවල ලබාගත් ප්රතිදීප්ත අගයන්ගෙන් අඩු කළ යුතුය.විවිධ තත්‍ය කාලීන PCR මෘදුකාංගවල නවතම අනුවාදයන් තනි සාම්පල සඳහා මූලික සැකසුම් ස්වයංක්‍රීයව ප්‍රශස්ත කිරීමට ඉඩ සලසයි.
PCR වර්ධක ප්රතික්රියාවේ පළමු චක්‍ර කිහිපය තුළ ප්රතිදීප්ත සංඥාව බොහෝ වෙනස් නොවේ.සරල රේඛාවකට ළඟා වීම මූලික රේඛාව ලෙස හැඳින්වේ, නමුත් අපි පළමු චක්‍ර කිහිපය දෙස හොඳින් බැලුවහොත්, අපට පෙනෙන්නේ පාදක රේඛාව තුළ පහත පින්තූරයේ සිදු වන දෙයයි.
පසුබිම පසුබිම සඳහන් කරයි
ප්රතික්රියාවේ නිශ්චිත නොවන ප්රතිදීප්ත අගය.උදාහරණයක් ලෙස: අකාර්යක්ෂම ප්රතිදීප්ත නිවාදැමීම;හෝ SYBR Green භාවිතය හේතුවෙන් ද්විත්ව නූල් සහිත DNA සැකිලි විශාල ප්‍රමාණයක්.තත්‍ය කාලීන PCR මෘදුකාංග ඇල්ගොරිතම මගින් සංඥාවේ පසුබිම් සංරචක ගණිතමය වශයෙන් ඉවත් කරනු ලැබේ.
වාර්තාකරු සංඥාව
Reporter signal යන්නෙන් අදහස් කරන්නේ SYBR Green මගින් ජනනය කරන ලද ප්රතිදීප්ත සංඥාව හෝ Real-Time PCR අතරතුර ප්රතිදීප්ත ලෙස ලේබල් කරන ලද අනුක්‍රමික-විශේෂිත පරීක්ෂණ.
සාමාන්‍යකරණය කළ වාර්තාකරු සංඥා (RN)
RN යනු එක් එක් චක්‍රයකදී මනිනු ලබන නිෂ්ක්‍රීය යොමු සායම්වල ප්රතිදීප්ත තීව්‍රතාවයෙන් බෙදන වාර්තාකරු සායම්වල ප්රතිදීප්ත තීව්‍රතාවයයි.
Passive Reference Dye
සමහර තත්‍ය කාලීන PCR වල,ROX ප්රතිදීප්ත සායම් ප්රතිදීප්ත සංඥාව සාමාන්‍යකරණය කිරීමට අභ්යන්තර යොමුවක් ලෙස භාවිතා කරයි..එය නිවැරදි නොවන පයිප්ප, ළිං පිහිටීම සහ ප්රතිදීප්ත උච්චාවචනයන් හේතුවෙන් ළිඳෙන් ළිං පදනම මත වෙනස්කම් නිවැරදි කරයි.
ප්රතිදීප්ත එළිපත්ත (ඉදිරිපස)
පසුබිම් අගයට ඉහළින් සහ විස්තාරණ වක්‍රයේ සානු අගයට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස පහතින් සකස් කර ඇත.එය PCR හඳුනාගැනීමේ ලඝු-රේඛීය පරාසය නියෝජනය කරමින් විස්තාරණ වක්‍රයේ රේඛීය කලාපය තුළ පිහිටා තිබිය යුතුය.PCR හි ලඝු-රේඛීය අදියර පහසුවෙන් හඳුනාගත හැකි වන පරිදි ලඝු-වර්ධක වක්ර දසුනෙහි එළිපත්ත සැකසිය යුතුය.තත්‍ය කාලීන PCR හි ඉලක්ක ජාන කිහිපයක් තිබේ නම්, එක් එක් ඉලක්කය සඳහා එළිපත්ත සැකසිය යුතුය.සාමාන්යයෙන්, PCR ප්රතික්රියාවේ පළමු චක්‍ර 15 හි ප්රතිදීප්ත සංඥාව ප්රතිදීප්ත පසුබිම් සංඥාව ලෙස භාවිතා කරන අතර, ප්රතිදීප්ත සීමාව PCR හි පළමු චක්‍ර 3 සිට 15 දක්වා ප්රතිදීප්ත සංඥාවේ සම්මත අපගමනය මෙන් 10 ගුණයක් වන අතර, ප්රතිදීප්ත PCR සීමාව ඝාතීය අවධියේ පිහිටුවා ඇත.සාමාන්යයෙන්, සෑම උපකරණයක්ම භාවිතයට පෙර එහි ප්රතිදීප්ත සීමාව සකසා ඇත.
චක්‍ර එළිපත්ත (CT) හෝ හරස් ලක්ෂ්‍යය (CP)
විස්තාරණ වක්රය එළිපත්ත තරණය කරන චක්‍රය (එනම්, ප්රතිදීප්ත හඳුනාගැනීම සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වන ලක්ෂ්‍යය).CT යනු භාගයක් විය හැකි අතර ආරම්භක අච්චුවේ ප්රමාණය ගණනය කළ හැක.CT අගය නියෝජනය කරන්නේ එක් එක් PCR ප්රතික්රියා නලයේ ප්රතිදීප්ත සංඥාව නියමිත සීමාවට ළඟා වන විට අත්විඳින චක්‍ර ගණනයි.එක් එක් සැකිල්ලේ CT අගය සහ සැකිල්ලේ මුල් පිටපත් අංකයේ ලඝුගණකය අතර රේඛීය සම්බන්ධයක් ඇත,ආරම්භක පිටපත් අංකය වැඩි, CT අගය කුඩා වන අතර, අනෙක් අතට.දන්නා ආරම්භක පිටපත් අංකයක් සහිත සම්මතයක් භාවිතා කිරීමෙන් සම්මත වක්රයක් සෑදිය හැක, එහි abscissa CT අගය නියෝජනය කරයි, සහ ordinate මඟින් ආරම්භක පිටපත් අංකයේ ලඝුගණකය නියෝජනය කරයි.එබැවින්, නොදන්නා නියැදියේ CT අගය ලබා ගන්නා තාක් කල්, නියැදියේ ආරම්භක පිටපත් අංකය සම්මත වක්‍රයෙන් ගණනය කළ හැක.
ΔCT අගය
ΔCT අගය විස්තර කරයිඉලක්ක ජානය සහ අනුරූප ආවේණික යොමු ජාන CT අගය අතර වෙනස, ගෘහ පාලන ජානයක් වැනි, සහ භාවිතා කරන අච්චු ප්රමාණය සාමාන්‍යකරණය කිරීමට භාවිතා කරයි:
⇒ΔCT = CT (ඉලක්ක ජානය) - CT (අභ්යන්තර යොමු ජානය)
ΔΔCT අගය
ΔΔCT අගය මගින් උනන්දුව දක්වන නියැදියක මධ්‍යන්‍ය ΔΔCT අගය (උදා, උත්තේජක සෛල) සහ සමුද්දේශ නියැදියක මධ්‍යන්‍ය ΔΔCT අගය (උදා, උත්තේජන නොකළ සෛල) අතර වෙනස විස්තර කරයි.විමර්ශන නියැදිය ක්රමාංකන නියැදිය ලෙසද හඳුන්වනු ලබන අතර අනෙකුත් සියලුම සාම්පල සාපේක්ෂ ප්රමාණකරණය සඳහා මෙයට සාමාන්‍යකරණය කර ඇත:
⇒ΔΔCT = සාමාන්ය ΔCT (උනන්දුව පිළිබඳ නියැදිය) - සාමාන්ය ΔCT (යොමු නියැදිය)
අන්තරාසර්ග යොමු ජාන (අන්තර්ජාතික යොමු ජාන)
ගෘහ පාලන ජාන (ගෘහ පාලන ජාන) වැනි ආවේණික යොමු ජානවල ප්‍රකාශන මට්ටම් සාම්පල අතර වෙනස් නොවේ.යොමු ජානයේ CT අගයන් ඉලක්ක ජානයට සංසන්දනය කිරීමෙන් ඉලක්ක ජානයේ ප්‍රකාශන මට්ටම ආදාන RNA හෝ cDNA ප්‍රමාණයට සාමාන්‍යකරණය කිරීමට ඉඩ සලසයි (ඉහත ΔCT අගයන් පිළිබඳ කොටස බලන්න).
අභ්යන්තර යොමු ජාන නිවැරදි වේහැකි RNA ක්ෂය වීම හෝ RNA සාම්පලවල එන්සයිම නිෂේධක පැවතීම, මෙන්ම RNA අන්තර්ගතයේ වෙනස්කම්, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව, න්යෂ්ටික අම්ල ප්‍රතිසාධනය සහ නියැදි හැසිරවීම.ප්‍රශස්ත යොමු ජාන(ය) තේරීමට, පර්යේෂණාත්මක සැකසුම මත රඳා පවතින ප්‍රශස්ත යොමු තේරීමට ඉඩ දීම සඳහා අපි ඇල්ගොරිතම වෙනස් කළෙමු.
අභ්යන්තර පාලනය
ඉලක්ක අනුක්‍රමයට සමාන ප්‍රතික්‍රියාවකින්ම විස්තාරණය කරන ලද පාලන අනුපිළිවෙලක් සහ වෙනත් පරීක්ෂණයකින් (එනම්, ද්විත්ව PCR ක්‍රියාකරමින්) විමර්ශනය කරයි.ඉලක්ක අනුපිළිවෙල අනාවරණය කර නොගත් අවස්ථා වැනි අසාර්ථක වර්ධක ඉවත් කිරීමට අභ්යන්තර පාලන බොහෝ විට භාවිතා වේ.
ක්රමාංකන නියැදිය
ජානයක සාපේක්ෂ ප්‍රකාශන මට්ටම තීරණය කිරීම සඳහා අනෙකුත් සියලුම සාම්පල සංසන්දනය කිරීම සඳහා සාපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණයේදී භාවිතා කරන විමර්ශන නියැදියක් (උදාහරණයක් ලෙස, සෛල රේඛාවකින් හෝ පටකයකින් පිරිසිදු කරන ලද RNA).ක්රමාංකන නියැදිය ඕනෑම සාම්පලයක් විය හැකි නමුත් සාමාන්යයෙන් පාලනයකි (උදාහරණයක් ලෙස, ප්රතිකාර නොකළ නියැදියක් හෝ අත්හදා බැලීමේ කාල ශුන්‍යයේ සිට සාම්පලයක්).
ධනාත්මක පාලනයන්
සමඟ පාලන ප්රතික්රියා භාවිතා කරන්නදන්නා අච්චු ප්‍රමාණයන්.ප්‍රයිමර් කට්ටලයක් හෝ ප්‍රයිමර්-ප්‍රොබ් කට්ටලයක් නිසි ලෙස ක්‍රියා කරන්නේද සහ ප්‍රතික්‍රියාව නිවැරදිව සකසා ඇත්දැයි පරීක්ෂා කිරීමට ධනාත්මක පාලන බොහෝ විට භාවිතා වේ.
සැකිලි පාලනයක් නැත (NTC)
සාමාන්යයෙන් ජලයෙන් ප්‍රතිස්ථාපනය වන අච්චුව හැර විස්තාරණ ප්රතික්රියාවේ අවශ්ය සියලුම සංරචක අඩංගු පාලන ප්‍රතික්‍රියාවකි.NTC භාවිතය මගින් ප්රතික්රියාකාරක අපවිත්‍ර වීම හෝ විදේශීය DNA මගින් ඇති වන දූෂණය සොයා ගත හැකි අතර එමඟින් අනාවරණය කිරීමේ දත්තවල සත්‍යතාව සහ විශ්වසනීයත්වය සහතික කෙරේ.NTC පාලනය විස්තාරණය කිරීම දූෂණය පෙන්නුම් කරයි.
RT පාලනයක් නැත (NRT)
RNA නිස්සාරණය කිරීමේ ක්‍රියාවලියේ අවශේෂ ප්‍රවේණික DNA අඩංගු විය හැක, එය අතිශයින් හානිකර වන අතර දත්තවල ගුණාත්මක භාවයට බලපාන වැරදිකරු සහ qPCR හි ස්වභාවික සතුරා වේ, එබැවින් අත්හදා බැලීම් සැලසුම් කිරීමේදී එය RNA හඳුනාගැනීම විස්තාරණය කිරීමට පමණක් නිර්මාණය කළ යුතුය.ක්රම දෙකක් තිබේ, එකක් ඉන්ට්‍රෝන හරහා ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කිරීම, අනෙක DNA සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් කිරීම, වඩා හොඳ කුමක්ද, එය පසුව සාකච්ඡා කෙරේ.NTR පාලනය DNA දූෂණය හඳුනා ගැනීමට මැජික් කැඩපතකි.විස්තාරණයක් තිබේ නම්, එයින් අදහස් වන්නේ දූෂණය ඇති බවයි.
ප්රමිති
සම්මතයන් යනු සම්මත වක්රයක් තැනීමට භාවිතා කරන දන්නා සාන්ද්‍රණයේ හෝ පිටපත් අංකයේ සාම්පල වේ.සම්මතයේ ස්ථායීතාවය සහතික කිරීම සඳහා, ජාන කොටස සාමාන්යයෙන් ප්ලාස්මිඩයට ක්ලෝන කර සම්මතය ලෙස භාවිතා කරයි.
සම්මත වක්රය
සාමාන්යයෙන් දෙගුණ කිරීමේ අනුපාතයට අනුව සම්මත නිෂ්පාදිතය සමඟ අවම වශයෙන් සාන්ද්‍රණ අනුක්‍රමික 5කට තනුක කර ඇති අතර, CT අගයේ සහ පිටපත් අංකයේ ඛණ්ඩාංකවල ලකුණු 5ක් ඇද ගන්නා අතර, සම්මත වක්රයක් ජනනය කිරීම සඳහා රේඛාවක් සෑදීමට ලකුණු සම්බන්ධ කර ඇත.එක් එක් සම්මත වක්රය සඳහා, එහි වලංගු භාවය පරීක්ෂා කිරීම අවශ්ය වේ.බෑවුමේ අගය -3.3 සහ -3.8 අතර වැටෙන අතර, එක් එක් සාන්ද්රණය තුන් ගුණයකින් සිදු කෙරේ.අනෙකුත් කරුණු වලින් සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වන ලකුණු ඉවත දැමිය යුතුය.පරීක්ෂා කිරීමට නියමිත නියැදියේ CT අගය සම්මත වක්රය තුළට ගෙන එන අතර, පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදියේ ප්‍රකාශන මට්ටම ගණනය කළ හැක.
පරීක්ෂා කිරීමට නියමිත නියැදියේ CT අගය සම්මත වක්රය තුළට ගෙන එන අතර, පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදියේ මුල් පිටපත් අංකය ගණනය කළ හැක.
කාර්යක්ෂමතාව සහ බෑවුම
සම්මත වක්‍රයේ බෑවුම තත්‍ය කාලීන PCR හි කාර්යක්ෂමතාවය නියෝජනය කරයි.
·-3.322 ක බෑවුමක් පෙන්නුම් කරන්නේ PCR වර්ධක කාර්යක්ෂමතාව 1 හෝ 100% කාර්යක්ෂම වන අතර PCR නිෂ්පාදන ප්රමාණය එක් එක් චක්‍රයකදී දෙගුණ වන බවයි.
-3.322 (උදා -3.8) ට අඩු බෑවුමක් PCR කාර්යක්ෂමතාවයක් පෙන්නුම් කරයි
· –3.322 (උදා, –3.0) ට වැඩි බෑවුමක් පෙන්නුම් කරන්නේ PCR කාර්යක්ෂමතාව 100% ට වඩා වැඩි බව පෙනේ, එය කුතුහලය දනවන කරුණකි, PCR හි එක් චක්‍රයක් විස්තාරණය කළ නිෂ්පාදනය මෙන් දෙගුණයකට වඩා ජනනය කරන්නේ කෙසේද?PCR ප්රතික්රියාවේ රේඛීය නොවන අවධියේදී මෙම තත්වය ඇතිවේ, එනම් විශේෂිත නොවන විස්තාරණය විශාල ප්‍රමාණයක් ඇත.
දියවන වක්රය
qPCR විස්තාරණය අවසන් වූ පසු, PCR නිෂ්පාදනය රත් වේ.උෂ්ණත්වය ඉහළ යන විට, ද්විත්ව නූල් විස්තාරණ නිෂ්පාදනය ක්රමක්රමයෙන් දියවී යන අතර, ප්රතිදීප්ත තීව්රතාවය අඩු වේ.යම් උෂ්ණත්වයක් (Tm) ළඟා වූ විට, නිෂ්පාදන විශාල සංඛ්යාවක් දිය වී යයි.ෆ්ලෝරසන්ස් තියුනු ලෙස පහත වැටේ.විවිධ PCR නිෂ්පාදනවල විවිධ Tm අගයන් සහ විවිධ ද්රවාංක උෂ්ණත්වයන් ඇති අතර, PCR හි නිශ්චිතභාවය හඳුනාගත හැකිය.
ද්රවාංක වක්රය (ව්‍යුත්පන්න වක්රය)
දියවන වක්රය ව්‍යුත්පන්න කර ඇත්තේ උච්ච සිතියමක් සෑදීම සඳහා වන අතර එමඟින් PCR නිෂ්පාදන කොටස්වල තත්ත්වය වඩාත් අවබෝධාත්මකව පෙන්විය හැකිය.ද්රවාංක උෂ්ණත්වය DNA කොටසෙහි Tm අගය වන බැවින්, DNA කොටසෙහි Tm අගයට බලපාන සමහර පරාමිතීන් ඛණ්ඩ ප්රමාණය, GC අන්තර්ගතය යනාදිය විනිශ්චය කළ හැක. සාමාන්යයෙන් කිවහොත්, අපගේ ප්රාථමික සැලසුම් මූලධර්මවලට අනුව,විස්තාරණය කරන ලද නිෂ්පාදනයේ දිග 80-300bp පරාසයක පවතී, එබැවින් දියවන උෂ්ණත්වය 80 ° C සහ 90 ° C අතර විය යුතුය.
දියවන වක්රය පිළිබඳ අර්ථ නිරූපණය: එකම ප්රධාන උච්චය 80°C-90°C අතර දිස්වන්නේ නම්, එයින් අදහස් වන්නේ ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR පරිපූර්ණ බවයි;ප්රධාන ශිඛරය 80°C-90°C අතර දිස්වන අතර විවිධ කඳු මුදුන් 80°Cට අඩුවෙන් දිස්වේ නම්, ප්‍රයිමර් ඩිමර් මූලික වශයෙන් සලකනු ලැබේ.එය විසඳා ගැනීම සඳහා ඔබට ඇනෙලිං උෂ්ණත්වය වැඩි කිරීමට උත්සාහ කළ හැකිය;ප්රධාන ශිඛරය 80°C-90°C අතර දිස්වන්නේ නම් සහ උෂ්ණත්වය ඉහළ යන විට විවිධ උච්චය නැවත දිස්වන්නේ නම්, DNA දූෂණයක් ඇති බව මූලික වශයෙන් සලකනු ලබන අතර, පරීක්ෂණයේ ආරම්භක අදියරේදී DNA ඉවත් කළ යුතුය.
ඇත්ත වශයෙන්ම, තවමත් සමහර අසාමාන්ය තත්වයන් ඇත, ඒවා එකින් එක පහතින් බිඳ දමනු ඇත.
3. උසස් දැනුම
qPCR කරන්න, මට කියන්න තියෙන්නේ MIQE,අවම තොරතුරුප්‍රකාශනය සඳහාප්රමාණාත්මකතත්‍ය කාලීන PCRඅත්හදා බැලීම් —තත්‍ය කාලීන ප්රමාණාත්මක PCR පිළිබඳ ලිපි පළ කිරීම සඳහා අවම තොරතුරුඅත්හදා බැලීම් .සෑම කෙනෙකුගේම අවබෝධය සරල කිරීම සඳහා, අපි ප්රධාන අන්තර්ගතය සරල කරන්නෙමු.
ඔබට අන්තර්ජාලයේ MIQE හි මුල් පෙළ සෙවිය හැකි අතර වඩාත්ම වැදගත් දෙය නම් එය නියම කර තිබීමයි.ලිපියක් පළ කිරීමේදී සැපයිය යුතු දත්ත පිරික්සුම් ලැයිස්තුව .
මෙම විස්තර කියවීමෙන් සමාලෝචකයින්ට අත්හදා බැලීමේ ගුණාත්මකභාවය විනිශ්චය කළ හැකිය;අනාගත පාඨකයන්ට අත්හදා බැලීම නැවත කිරීමට හෝ වැඩිදියුණු කිරීමට මෙය භාවිතා කළ හැක.
මෙම ලැයිස්තුවේ, එක් එක් ලැයිස්තුවේ වැදගත්කම පිළිවෙලින් E හෝ D වලින් සලකුණු කර ඇති බව සඳහන් කිරීම වටී.එයින් අදහස් කරන්නේ කුමක් ද?ඊ: අත්යවශ්ය තොරතුරු (ඉදිරිපත් කළ යුතුය);D: අවශ්ය තොරතුරු (හැකි තරම් ලබා දෙන්න).
MIQE (1)-පර්යේෂණාත්මක නිර්මාණය
උපාධි අධ්‍යාපනය අවසන් කිරීමෙන් පසු ආරක්ෂාව සම්පූර්ණ කළ බොහෝ ජරා මිනිසුන් ස්වාධීනව අත්හදා බැලීමක් සැලසුම් කරන්නේ කෙසේද, ඔවුන්ගේ සටහන් පොත් විවෘත කරන්නේ කෙසේද සහ ගුරුවරයා පවසන දේ කරන්නේ කෙසේදැයි නොදනී.මේ නිසා පර්යේෂණාත්මක නිර්මාණය දැඩි නොවූ අතර සඟරාවේ කතුවැකි අංශය කියා සිටියේ මෙම පින්තූරය සහ එම පින්තූරය සෑදීමට අවශ්ය බවයි, එබැවින් ඔවුන් එය කළේ අන්ධභාවයෙන් බවයි.ජරාව හදන්නේ මෙහෙමයි!
නිවසට සමීපව, අත්හදා බැලීමේ පළමු මූලධර්මය තීරණය කිරීමයිපර්යේෂණාත්මක තර්කනයේ දැඩි බව.වඩාත්ම මූලික දෙය වන්නේ පර්යේෂණාත්මක සැලසුම වන අතර පර්යේෂණාත්මක සැලසුමේ වැදගත්ම දෙය වන්නේ ඉලක්ක නියැදිය, විමර්ශන නියැදිය (පාලනය) සහ පුනරාවර්තන ගණන සකසන්නේ කෙසේද යන්නයි, එවිට පර්යේෂණාත්මක දත්ත යොමු කළ හැකි, සැසඳිය හැකි සහ ඒත්තු ගැන්විය හැකිය.
ඉලක්ක නියැදියනිශ්චිත ප්‍රතිකාරයකින් පසු ඉලක්කගත ජානය හඳුනා ගැනීමට අපට අවශ්ය නියැදිය වෙත යොමු වේ.යොමු නියැදියජීව විද්‍යාවේ වල් වර්ගය ලෙස බොහෝ විට හඳුන්වනු ලබන කිසිදු ප්‍රතිකාරයකින් තොරව නියැදිය වේ.
පර්යේෂණාත්මක අනුරූඉතා වැදගත් වේ.සාමාන්යයෙන්, ඒත්තු ගැන්වෙන අනුරූ ගණන තුනකට වඩා වැඩි විය යුතුය.ජීව විද්යාත්මක අනුකරණය යනු කුමක්ද සහ තාක්ෂණික අනුකරණය යනු කුමක්ද යන්න වෙන්කර හඳුනා ගැනීම අවශ්ය වේ.
ජීව විද්යාත්මක අනුරූ: විවිධ ද්රව්ය (කාලය, ශාක, කාණ්ඩ, ප්රතික්රියා තහඩු) සමඟ සිදු කරන ලද එකම සත්‍යාපන අත්හදා බැලීම.
ජීව විද්යාත්මක අනුපිටපත් කිරීම
ගම්මිරිස්වල පළිබෝධනාශක ප්රතිකාරය උදාහරණයක් ලෙස ගනිමු.අපට ABC හි පැල තුනට පළිබෝධනාශක ඉසීමට අවශ්ය වේ, එවිට ABC හි පැල තුන ජීව විද්යාත්මක අනුරූ තුනක් වන අතර ඒවා විවිධ ද්රව්ය සමඟ සිදු කරන ලද එකම සත්‍යාපන පරීක්ෂණයකි.නමුත් අත්හදා බැලීමක් ලෙස අනිවාර්යයෙන්ම පාලනයක් අවශ්ය වේ, එබැවින් A ශාකයේ පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායමක් සෑදීමට A ශාකයේ එක් ශාඛාවක් ඉසිය හැකි අතර පාලන කණ්ඩායමක් සෑදීමට A ශාකයේ අනෙක් අතු ඉසීම නොවේ.B සහ C සඳහාද එසේ කරන්න.
තාක්ෂණික අනුරූ (තාක්ෂණික අනුරූ): එය ක්‍රියාවෙන් සිදුවන දෝෂ මඟහරවා ගැනීම සඳහා නැවත නැවත කරන ලද අත්හදා බැලීමකි, එය ඇත්ත වශයෙන්ම එකම ද්‍රව්‍යයේ ඇතුළත් අනුපිටපත් සිදුරකි.ප්රතිකාර සහ පාලනය යන දෙකෙහිම ඉලක්ක ජානයේ සහ අභ්යන්තර විමර්ශන ජානයේ අනුරූ සැකසුම් (අවම තුනක්) තිබිය යුතුය.
තාක්ෂණික පුනරාවර්තනය
නැවතත් උදාහරණයක් ලෙස පළිබෝධනාශක යෙදූ ගම්මිරිස් ගන්න.ශාක A හි පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායම සඳහා, අපි එහි ඉලක්කගත ජානය සහ අභ්යන්තර විමර්ශන ජානය සඳහා පිළිවෙලින් 1, 2, සහ 3 PCR සිදුරු තුනක් සෑදුවෙමු, එමඟින් අනාවරණය කිරීමෙන් පසු සාමාන්‍යය ලබා ගැනීමට හැකි විය.ශාක පාලනය සඳහා A කණ්ඩායම් ද ඒ ආකාරයෙන්ම සලකනු ලැබේ.ඒ හා සමානව, B සහ C ශාක සඳහා එකම ප්රතිකාර කරන්න.මෙය තාක්ෂණික පුනරාවර්තනයකි.
බව සඳහන් කිරීම වටීසංඛ්‍යාලේඛනවලට ඇතුළත් වන්නේ ජීව විද්යාත්මක පුනරාවර්තනය වන අතර තාක්ෂණික පුනරාවර්තනය වන්නේ පර්යේෂණාත්මක ක්‍රියාවලියේ අහඹු සංසිද්ධි තිබේද යන්න පරීක්ෂා කිරීමයි, එවිට පර්යේෂණාත්මක ප්රතිඵල විශ්වසනීය වන පරිදි, එනම්, අප නිතර පවසන පරිදි ඒවායේ සාමාන්‍යය ගනිමින් දෝෂ මඟහරවා ගැනීමයි.
සෘණ පාලන-NTC සහ NRT
NTC (නිර්ම-සැකිලි පාලනය), සැකිල්ලක් නොමැති පාලනයක්, පර්යේෂණාත්මක ද්රව්ය දූෂිත දැයි තහවුරු කිරීමට භාවිතා කරයි.සාමාන්යයෙන් ජලය සැකිල්ලක් ලෙස භාවිතා කරයි.ප්රතිදීප්ත ප්රතික්රියාවක් තිබේ නම්, එය රසායනාගාරයේ න්යෂ්ටික අම්ල දූෂණය සිදුවී ඇති බව පෙන්නුම් කරයි.
මෙම දූෂණය පැමිණෙන්නේ: අපිරිසිදු ජලය, ආවේණික DNA අඩංගු නුසුදුසු ප්රතික්රියාකාරක, ප්රාථමික දූෂණය, රසායනාගාර උපකරණ දූෂණය, aerosol දූෂණය යනාදිය, RNase ස්කැවෙන්ජර් සහ RNase නිෂේධක භාවිතා කළ යුතුය.Aerosol දූෂණය සොයා ගැනීමට වඩාත්ම දුෂ්කර වේ.ඔබේ රසායනාගාරය දුමාරයක් වැනි යැයි සිතන්න, වාතයේ විවිධ න්යෂ්ටික අම්ල අත්හිටුවා ඇත.
NRT (නො-ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම), ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමකින් තොරව පාලනය, gDNA අපද්‍රව්‍ය පාලනය කරන ඍණ පාලනයක් ලෙස ප්රතිලෝම නොවන පිටපත් කරන ලද RNA වේ.
ජාන ප්‍රකාශනය කරන විට, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමෙන් පසු cDNA ප්රමාණය හඳුනා ගැනීමෙන් RNA ප්රමාණය අනාවරණය වේ.RNA පිරිසිදු කරන විට gDNA අවශේෂ තිබේ නම්, එය පර්යේෂණාත්මක ප්රතිඵලවල දෝෂ ඇති කරයි, මන්ද සැබෑ ප්රතිඵලය gDNA සහ cDNA වේ.සමස්ථ මට්ටමින්, cDNA පමණක් නොව, RNA නිස්සාරණයේදී gDNA සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් කළ යුතුය.
MIQE (2) - නියැදි තොරතුරු
ඊනියා නියැදි තොරතුරු යන්නෙන් අදහස් කරන්නේ අපි qPCR පිළිබඳ ලිපියක් ප්රකාශයට පත් කරන විට, අපි ලිපියේ අනිවාර්ය අංගයක් වන නියැදි තොරතුරු පැහැදිලිව පැහැදිලි කළ යුතු බවයි.ඒ හා සමානව, අපි සාම්පල සකසන විට, සාම්පලවල වලංගුභාවය සහතික කිරීම සඳහා අපගේම මෙහෙයුම් නියාමනය කළ යුතුය.
නියැදියේ විස්තරය ප්රතිඵලය පමණක් වන අතර, සම්පූර්ණ අත්හදා බැලීමේදී ගන්නා ලද ද්රව්ය කෙරෙහි වැඩි අවධානයක් යොමු කළ යුතුය.
පර්යේෂණාත්මක ද්රව්ය තෝරාගැනීම
රුධිර සාම්පල - නැවුම් රුධිරය තෝරන්න, පැය 4 කට වඩා වැඩි නොවේ.සෛල සාම්පල - ප්‍රබල වර්ධනයක් ඇති කාල පරිච්ඡේදයකදී නැවුම් සෛල එකතු කිරීමට තෝරා ගන්න.සත්ව පටක - නැවුම්, දැඩි ලෙස වර්ධනය වන පටක තෝරන්න.ශාක පටක - නැවුම්, තරුණ පටක තෝරන්න.
මෙම වාක්‍ය කිහිපය තුළ ප්රධාන වචනයක් ඇති බව ඔබ දැක ඇති: නැවුම් .
ඉහත සාම්පල සඳහා, වෙළඳපොලේ ඇති හොඳම, පිරිවැය-ඵලදායී සහ ස්ථාවර කට්ටලය වන්නේ Foregene's කට්ටලය වන අතර, ඒවායේ DNA සහ RNA ඉක්මනින් හා පහසුවෙන් ලබා ගත හැක.
සෛල සම්පූර්ණ RNA හුදකලා කට්ටලය
ශාක සම්පූර්ණ RNA හුදකලා කට්ටලය
ශාක සම්පූර්ණ RNA හුදකලා කට්ටලය ප්ලස්
පර්යේෂණාත්මක ද්රව්ය ගබඩා කිරීම
සාමාන්යයෙන් කතා කරන්නේ නම්, කොන්දේසි අනුමත කරන්නේ නම්, සාම්පල ගබඩා කිරීම අපි නිර්දේශ නොකරමු.කෙසේ වෙතත්, නියැදීමෙන් පසු වහාම අත්හදා බැලීම් කළ නොහැකි මිතුරන් බොහෝ දෙනෙක් සිටින අතර සමහරුන්ට නියැදීම සඳහා ක්ෂේත්‍රයට දියර නයිට්‍රජන් ටැංකි රැගෙන යාමට පවා අවශ්ය වේ.
මේ ආකාරයේ වෙහෙස මහන්සි වී වැඩ කරන මිතුරෙකු සඳහා, ඔබට ප්රතික්රියාකාරක පරිභෝජන ද්රව්ය නොතේරෙන බව පමණක් පැවසිය හැකිය.දැන් බොහෝ ප්රතික්රියාකාරක පරිභෝජන සමාගම් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී RNA සාම්පල ගබඩා කළ හැකි ප්රතික්රියාකාරක නිපදවන අතර ඔබට ඒවා භාවිතා කිරීමට තෝරා ගත හැකිය.සාම්ප්‍රදායික ගබඩා ක්රමය දියර නයිට්‍රජන් ගබඩා කිරීම, රැගෙන යාමට පහසු කුඩා ද්‍රව නයිට්‍රජන් ටැංකියක් භාවිතා කරයි.නියැදිය රසායනාගාරයට ගෙන ඒමෙන් පසු -80 ° C ශීතකරණයක් තුළ ගබඩා කරන්න.
RNA සම්බන්ධ පරීක්ෂණ සඳහා, වචන හයක මූලධර්මය අනුගමනය කළ යුතුය:අඩු උෂ්ණත්වය, එන්සයිම නොමැති,සහඉක්මනින් .
අඩු උෂ්ණත්වය පිළිබඳ සංකල්පය තේරුම් ගැනීමට පහසුය;එන්සයිම නොමැතිව, RNase අප ජීවත් වන ලෝකයේ සෑම තැනකම පවතී (එසේ නොවුවහොත් ඔබ HIV මගින් මරා දමනු ඇත), එබැවින් අත්හදා බැලීම් කිරීමේදී RNase වළක්වා ගන්නේ කෙසේද යන්න ඉතා වැදගත් සංකල්පයකි;ඉක්මනින්,කඩන්න බැරි කුං ෆු ලෝකයේ නැහැ, වේගය පමණක් කඩන්න බැහැ.
එමනිසා, එක් අර්ථයකින්, නිස්සාරණය කිරීමේ කාලය කෙටි වන තරමට, කට්ටලය වඩා හොඳය.ඇයි කරන්නේපෙරනිමිතිගේ කට්ටලය වේගය අවධාරණය කරයි, මන්ද ඔවුන් එය හොඳින් දන්නා බැවිනි.
ප.ලි: සමහර ගෑනු ළමයි ගොඩක් පරිස්සමෙන් අත්හදා බැලීම් කරනවා, හැබැයි අවුරුදු ගාණක් වැඩ කරලා slam dunk වගේ හොඳ නැහැ.ඔවුන් සිතන්නේ දෙවියන් වහන්සේ අසාධාරණ බවත්, අන් අය ගැන පැමිණිලි කරන බවත්, ජීවිතය සොයන බවත්ය.ඇත්ත වශයෙන්ම, ඇය එය තේරුම් ගත්තේ නැත.ඔහු RNA හොඳින් ආරක්ෂා නොකළ අතර slam dunk ක්‍රීඩකයා වේගවත් විය.ඔහු අත්හදා බැලීම කරන විට, ඔහු තුන් වරක්, පස් වතාවක් සහ බෙදීම් දෙකකින් ස්ලැම් ඩන්ක් අවසන් කරයි යැයි සිතූ නමුත් ඔහු අත්හදා බැලීම හොඳින් කළේය.
සටහන: මන්දගාමී, RNase ආක්‍රමණයේ වැඩි අවස්ථා.වේගවත් වීමට ඔබම පුහුණු කරන්නේ කෙසේද?ක්රමයක් නැහැ, වැඩිපුර පුරුදු කරන්න.
විවිධ අත්හදා බැලීම් සහ විවිධ සාම්පල සඳහා, තවත් සාහිත්යය කියවීමට සහ සැකසීම සඳහා සුදුසු ක්රමයක් තෝරා ගැනීමට තවමත් අවශ්ය වේ.නියැදි එකතු කිරීමේ සහ ගබඩා කිරීමේ ක්‍රියාවලිය සඳහා, MIQE විසින් එය කඩදාසියේ පැහැදිලිව ලියා තිබීම අවශ්ය වේ, එවිට සමාලෝචකයින්ට පත්‍රිකාවේ විශ්වසනීයත්වය සමාලෝචනය කළ හැකි අතර, විස්මයට පත් තරුණයින්ට ඔබේ අත්හදා බැලීම නැවත කිරීමට පහසු වේ.
ජීව විද්යාත්මක අත්හදා බැලීම් අපහසු වුවත් ඒවා උසස් මට්ටමේ ඒවා වේ.ඔබ පරෙස්සම් නොවන්නේ නම්, ඔබට ලෝකය පෙරළා දැමිය හැකිය.උදාහරණයක් ලෙස, SARS ජෛව රසායනික අර්බුදයක් බවට පත් කිරීම හෝ බිලියන 1.3 ක ජනතාවක් බේරා ගැනීම සඳහා දෙමුහුන් සහල් සෑදීම.පහත පින්තූරය රසායනික අත්හදා බැලීමකි, ඔහුගේ කිනිතුල්ලෙකුගේ පෙනුම දෙස බැලීමෙන් ඔබ ඔබේ පර්යේෂණය ගැන කෙතරම් ආඩම්බරද යන්න තේරුම් ගත යුතුය.එය අමතක කරන්න, ඔහුව කළු කරන්න එපා.
MIQE (3) - න්යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණය.
න්යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණය විශාල සිදුවීමක් වන අතර සියලුම අණුක ජීව විද්‍යා පරීක්ෂණ ආරම්භ වන්නේ න්යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණයෙනි.පළමුවෙන්ම, අපි නියුක්ලික් අම්ල නිස්සාරණය පිළිබඳ MIQE හි අන්තර්ගතය පිටපත් කරමු.
මෙම ආකෘතිය දෙස බලන විට, ඔබට මතුපිට රැඳී සිටිය නොහැක.ස්වරූපය ධර්මයකි.ඉහළම ශිෂ්‍යයෙකු වීමට නම්, ඔබ එයට හේතුව ඇසිය යුතුය.මෙම වගුවේ අත්යවශ්ය අන්තර්ගතය වන්නේ: ලුහුබැඳීමRNA හි සංශුද්ධතාවය, අඛණ්ඩතාව, අනුකූලතාව සහ නිස්සාරණ ප්රමාණය .
හි පළමු කොටසක්‍රියාවලිය හෝ උපකරණය යනු න්යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණ පියවරයි.ඔබ නිස්සාරණය සඳහා ස්වයංක්‍රීය න්යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරකයක් භාවිතා කරන්නේ නම් (උසස්, කරුණාකර මිලදී ගැනීම සඳහා මා අමතන්න), ඔබ උපකරණයේ ආකෘතියේ නම සඳහන් කළ යුතුය.
කට්ටලයේ නම සහ
වෙනස් කිරීමේ විස්තර සඳහා භාවිතා කරන ලද කට්ටලය කුමක්ද, විශේෂ ප්රතික්රියාකාරක එකතු කළේ කුමක්ද හෝ විශේෂ මෙහෙයුම් මොනවාද යන්න පැහැදිලිව පැහැදිලි කළ යුතු අතර එවිට අන් අයට පහසුවෙන් ඔබේ අත්හදා බැලීම නැවත කළ හැකිය.
සමහර අය විශේෂ සාම්පල නිස්සාරණය කිරීමේදී විශේෂ ප්රතික්රියාකාරක කිහිපයක් එකතු කරයි, මෙය ඔවුන්ගේ රහස් ආයුධය යැයි සිතා අන් අයට නොකියයි.එය රහසිගතව තබා ගනිමින් ඔබේ ලිපිය බැබළවීමට ඇති අවස්ථාවද ඔවුන්ට අහිමි වේ.දක්ෂ වෙන්න එපා, විද්යාත්මක පර්යේෂණවලදී රට පැරැණි Zhang ට වඩා අවංක විය යුතුයි, දක්ෂ වෙන්න නම් ලිපිය ඔබව මෝඩයෙක් කරයි.
කට්ටලයේ නිෂ්පාදන අංකය මතක තබා ගත යුතුයඔබ කට්ටලය ඇණවුම් කර ලිපිය ලියන විට.කට්ටලය මත සාමාන්යයෙන් අංක දෙකක් ඇත: Cat—නාමාවලි අංකය (නිෂ්පාදන අංකය, ලිපි අංකය), කැබලි අක්ෂරය—නිෂ්පාදන කැබලි අංකය (භාවිතා කරන්නේ නිෂ්පාදිතය පැමිණියේ කුමන කාණ්ඩයෙන්ද යන්න දැක්වීමටය).
මීට අමතරව, ජෛව රසායනික ප්රතික්රියාකාරක ඇණවුම් කිරීමේදී CAS අංකය බොහෝ විට භාවිතා වන අතර, මම එය එකට ප්රචලිත කරමි.CAS අංකය යනු සෑම නව රසායනික ඖෂධයකටම ඇමරිකානු රසායනික සංගමය විසින් ලබා දෙන අංකයයි.සාමාන්යයෙන් ඉලක්කම් තුනක් ඉරකින් සම්බන්ධ වේ.රුෂුයිගේ CAS අංකය: 7732-18-5.රසායනවලට බොහෝ විට අන්වර්ථ කිහිපයක් ඇත, නමුත් CAS අංකය අද්විතීයයි.ඖෂධ ඇණවුම් කිරීමේදී, ඔබට මුලින්ම එහි CAS අංකය පරීක්ෂා කළ හැකිය.
නිවසට සමීපව, අපි මේ දේවල් පැහැදිලිව විස්තර කළ යුත්තේ ඇයි?ඇත්ත වශයෙන්ම, එය RNA නිස්සාරණයේ ගුණාත්මකභාවය පරීක්ෂා කිරීම ද වේ.උපකරණ සහ කට්ටල භාවිතය RNA නිස්සාරණය වඩාත් ස්ථාවර කරයි.සාමාන්ය රසායනාගාරවල නිස්සාරණ පරිමාණය විශාල නොවන අතර, එය කට්ටල සමඟ ලබා ගත හැකිය.
DNase හෝ RNase ප්රතිකාර පිළිබඳ විස්තර
ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR හි වැදගත් ප්‍රශ්නය වන්නේ DNA අපවිත්‍ර වීම වැලැක්වීම වන අතර, දූෂණයක් තිබේ නම් අත්හදා බැලීම් නොකරන්න.එබැවින්, පරීක්ෂණ ක්‍රියාවලියේ DNA සම්පූර්ණයෙන්ම සහ සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් කර ඇති බව පෙන්නුම් කිරීම සඳහා, DNA සැකසීමට ඔබ භාවිතා කළ ක්‍රියාවලිය සඳහන් කිරීම අත්යවශ්ය වේ.ක්රමානුරූප රූප සටහනක් මගින් නිරූපණය කෙරේ.
RNA සහ DNA වල ක්රමානුරූප රූප සටහන
සාමාන්යයෙන් DNA ඉවත් කිරීමේ ක්රමය වන්නේ නිස්සාරණයෙන් පසු RNA වලට DNase සමඟ ප්රතිකාර කිරීමයි.කෙසේ වෙතත්, මේවා සාපේක්ෂව පැරණි ක්රම වේ.වාණිජ RNA නිස්සාරණ කට්ටලවලට DNase එකතු නොකර නිස්සාරණය කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී DNA ඉවත් කිරීමට හැකි වී ඇත.උදාහරණයක් ලෙස, Foregene වෙතින් කට්ටල මාලාවක්.
සටහන: RNA නිස්සාරණයේදී DNA ඉවත් කිරීම ඉතා භයානක දෙබිඩි කඩුවක් වන අතර, එය RNA නිස්සාරණයේ ක්‍රියාකාරී කාලය දීර්ඝ කර RNA ක්ෂය වීමේ අවදානම වැඩි කරයි.මූලික වශයෙන්, එය RNA අස්වැන්න සහ සංශුද්ධතාවය අතර හුවමාරුවකි.
මීට අමතරව, සිලිකා මත පදනම් වූ adsorption තීරුවට එකතු කරන ලද DNase ප්රමාණය ඉතා කුඩා වන අතර, බලපෑම ලබා ගැනීම සඳහා උසස් තත්ත්වයේ DNase භාවිතා කළ යුතුය.Unoptimized DNase ඉක්මනින් හා සම්පූර්ණයෙන්ම ජීර්ණය කළ නොහැක.මෙය වෙළෙන්දාගේ තාක්ෂණික මට්ටම පිළිබඳ පරීක්ෂණයකි.ඇත්ත වශයෙන්ම, DNase නොමැතිව DNA ඉවත් කළ හැකි බවට පුරසාරම් දොඩන තවත් අමුතු වෙළෙන්දෝ සිටිති.ඩීඑන්ඒස් නොමැතිව ඩීඑන්ඒ සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් කළ හැකි යැයි පුරසාරම් දොඩන ඕනෑම අයෙක් හොල්මන් යැයි කිව හැකිය.DNA යනු සාපේක්ෂ වශයෙන් ස්ථායී ද්විත්ව නූල් ව්‍යුහයක් වන අතර එය කතා කිරීමෙන් හා සිනාසීමෙන් පමණක් අතුගා දැමිය නොහැක.
දූෂණය තක්සේරු කිරීම
තක්සේරු ක්රමය: විද්යුත් විච්ඡේදනය හඳුනාගැනීම, 1% agarose, 6V/cm, 15min, පැටවීම 1-3 ul
න්යෂ්ටික අම්ල ප්රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය
සාමාන්යයෙන් UV වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාමාපකය භාවිතයෙන් මනිනු ලැබේ.මම මුලින්ම OD260, OD280 සහ OD230 යන අගයන් තුනේ තේරුම ජනප්‍රිය කිරීමට ඉඩ දෙන්න.
·OD260nm: එය න්යෂ්ටික අම්ලයේ ඉහළම අවශෝෂණ උච්චයේ අවශෝෂණ තරංග ආයාමය වන අතර හොඳම මනින ලද අගය 0.1 සිට 1.0 දක්වා පරාසයක පවතී.එසේ නොවේ නම්, නියැදිය පරාසය තුළට ගෙන ඒම සඳහා තනුක හෝ සාන්ද්රණය කරන්න.
·OD280nm: එය ප්‍රෝටීන් සහ ෆීනෝලික් ද්‍රව්‍යවල ඉහළම අවශෝෂණ උච්චයේ අවශෝෂණ තරංග ආයාමයයි.
·OD230nm: එය කාබෝහයිඩ්‍රේටවල ඉහළම අවශෝෂණ උච්චයේ අවශෝෂණ තරංග ආයාමයයි.
ඊළඟට, අපි එක් එක් දර්ශකයේ කාර්යභාරය ගැන කතා කරමු.A260 සඳහා, එය න්යෂ්ටික අම්ලයේ අස්වැන්න මැනීමට භාවිතා කළ හැක.විට OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
සංශුද්ධතාවය සඳහා, අප සාමාන්යයෙන් දකින අනුපාතයන් දෙස බැලිය යුතුය: OD260/280 සහ OD260/230.
පිරිසිදු DNA: OD260/280 ආසන්න වශයෙන් 1.8 ට සමාන වේ.එය 1.9 ට වඩා වැඩි වූ විට RNA දූෂණයක් ඇති බවත් 1.6 ට වඩා අඩු වූ විට ප්‍රෝටීන් සහ ෆීනෝල් දූෂණයක් ඇති බවත් පෙන්නුම් කරයි.
පිරිසිදු RNA: 1.7
·OD260/230: එය DNA හෝ RNA වේවා, යොමු අගය 2.5 වේ.2.0 ට වඩා අඩු වූ විට, සීනි, ලුණු සහ කාබනික ද්රව්ය දූෂණය ඇති බව පෙන්නුම් කරයි.
RNA අඛණ්ඩතාව
RNA හි අඛණ්ඩතාව මැනීම ඉතා වැදගත් වේ.සාමාන්යයෙන්, 28S සහ 18S RNA අතර දීප්තිය දෙගුණයක සම්බන්ධතාවයක් දැයි පරීක්ෂා කිරීම සඳහා RNA denaturation gel පරීක්ෂණයක් කිරීම අවශ්ය වේ.තෙවන කලාපය 5S දිස්වන විට, ඉන් අදහස් වන්නේ අපෘෂ්ඨවංශීන් හැර RNA ක්ෂය වීමට පටන් ගෙන ඇති බවයි.
RNA තත්ත්ව තක්සේරුව සඳහා දත්ත: ඉහත පරීක්ෂණවලට අමතරව, RNA අඛණ්ඩතාව අනුව, RNA අදෘශ්‍යමාන ලෙස ක්ෂය වී ඇත්ද යන්න හඳුනා ගත හැකි එක්ස්පීරියන් ස්වයංක්‍රීය ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් පද්ධතියේ RQI අඛණ්ඩතා පරීක්ෂණය වැනි තවත් දියුණු උපකරණ පරීක්ෂණ කිහිපයක් ද ඇත.
විද්යාත්මක පර්යේෂණවලදී, ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR යනු ඉලක්කගත ජානය සහ අභ්යන්තර විමර්ශන ජානය අතර සංසන්දනයකි.එබැවින්, RNA සාම්පල සංරක්ෂණය, RNA නිස්සාරණය යනාදී ක්‍රියාවලියේදී, මූලික ඉලක්කය වන්නේ RNA හි අඛණ්ඩතාව සහතික කිරීමයි.
ඉලක්කගත ජානය සහ අභ්යන්තර විමර්ශන ජානය අතර සමතුලිතතාවයට RNA හි අඛණ්ඩතාව බලපාන ආකාරය පහත රූපයෙන් පහසුවෙන් තේරුම් ගත හැක.පරිහානිය ජාන අසම්පූර්ණ භාවයට තුඩු දෙනු ඇත, එය අභ්යන්තර විමර්ශන ජානයේ අසම්පූර්ණ භාවය හෝ ඉලක්කගත ජානයේ අසම්පූර්ණත්වය වේවා, එය දත්ත කෙරෙහි විශාල බලපෑමක් ඇති කරයි.
ඉලක්ක ජාන සහ විමර්ශන ජානවල ක්‍රමානුකූල රූප සටහන සත්‍ය නොවිය යුතුය
නිෂේධන පරීක්ෂණය (සීටී අගය වැඩි හෝ අඩු සාන්ද්‍රණයක් යටතේ හෝ වෙනත් තත්ව යටතේ යටපත් කර තිබේද යන්න)
මෙම රූපය උදාහරණයක් ලෙස ගතහොත් වක්ර පහේ Ct අගයන් පහත පරිදි වේ.වක්ර අතර CT අගයන් බෙදා හැරීම අසමාන වන අතර Ct අගයන් PCR නිෂේධනය වන ඉහළ සහ අඩු සාන්ද්‍රණයන් යටතේ ප්‍රමාද වේ.
ප්රධාන කරුණ: ආර්එන්ඒ නිස්සාරණය කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී, අප වැරදි වැටහීම් අත්හැර නිවැරදි ඒවා ස්ථාපිත කළ යුතුය.
වැරදි අදහස නම්: RNA නිස්සාරණය පමණක් අස්වැන්න පසුපස හඹා යයි, ලබා ගන්නා RNA ප්රමාණය විශාල වන තරමට වඩා හොඳය.ඇත්ත වශයෙන්ම, අපි ප්රමාණකරණය කරන විට, ජාන සංඛ්‍යාව ඉතා විශාල නොවේ නම්, අපට වැඩි RNA අවශ්ය නොවේ.ඔබ නිස්සාරණය කරන RNA ප්රමාණය ප්‍රමාණවත් තරම් වැඩිය.
නිවැරදි සංකල්පය වන්නේ:RNA නිස්සාරණය සංශුද්ධතාවය, අඛණ්ඩතාව සහ අනුකූලතාවය අනුගමනය කළ යුතුය.සංශුද්ධතාවයට පසුකාලීන ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම බාධාවක් නොවන බව සහතික කළ හැකි අතර දත්ත DNA මගින් බලපෑමට ලක් නොවේ.අඛණ්ඩතාව ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි සහ අභ්යන්තර යොමුවල ශේෂය සහතික කරයි.අනුකූලතාව ස්ථාවර නියැදි පැටවීම සහතික කරයි.
MIQE (4) - ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම
වැරදි වැටහීම: ඉහළ නියැදි පරිමාවක් ලුහුබැඳීම.
නිවැරදි සංකල්පය: පටවන ලද RNA ප්රමාණය කුමක් වුවත්, cDNA හි වෙනස්කම් සැබෑ ලෙසම mRNA හි වෙනස්කම් පිළිබිඹු කළ හැකි බව සහතික කරමින්, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව අඛණ්ඩව පවතී.
අපි මෙම ක්‍රියාවලිය ක්රමානුරූප රූප සටහනකින් පැහැදිලි කරන්නෙමු:
ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාවයේ ක්රමානුරූප රූප සටහන, සත්‍ය නොවන්න
ප්‍රථමයෙන්ම, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය සහ PCR ක්‍රියාවලිය අතර වෙනස අප තේරුම් ගත යුතුය.PCR බහු තාපන සහ නිර්වින්දන ක්‍රියාවලි වලට භාජනය වන අතර ඉලක්ක කොටස ඝාතීය ලෙස වර්ධනය වේ;ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමෙහි මෙම ක්‍රියාවලිය නොමැති අතර, ප්‍රතිවර්තන ක්‍රියාවලියේදී, RNA කැබලි බොහෝ ප්‍රමාණයක් ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම ඇත්ත වශයෙන්ම එකින් එක සිදුවන බව අපට සිතිය හැක.
cDNA තොරතුරු කෑලි ප්‍රමාණයක් ලබා ගත හැකි බැවින්, එය මේ වන විට තේරුම් ගත යුතුය, මන්ද විශාල හා කුඩා කොටස් ප්රතිලෝම ලෙස පිටපත් කර ඇති අතර එක් කැබැල්ලක් කෙරෙහි අවධානය යොමු කළ නොහැක.තවද RNA ප්රමාණය සාපේක්ෂ වශයෙන් කුඩා බැවින්, ලබාගන්නා cDNA ප්‍රමාණයද විස්තාරණ බලපෑමක් ඇති PCR මෙන් නොව, සාපේක්ෂ වශයෙන් කුඩා වේ, එබැවින් එය මූලික වශයෙන් හඳුනා ගැනීමට නොහැක.
cDNA ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් ප්රතිඵල
දෙවනුව, ඉතා මැනවින්, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම එකින් එක සිදු කරනු ලැබේ, නමුත් කිසිදු සමාගමකින් ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමකට මෙම බලපෑම ලබා ගත නොහැක.මූලික වශයෙන්, බොහෝ ප්රතිලෝම පිටපත්වල කාර්යක්ෂමතාව 30-50% අතර ඉබාගාතේ යයි.මෙය එසේ නම්, අපට සාපේක්ෂව ස්ථායී ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාවයක් ඇත, එය අපට රූපයේ දැකීමට අවශ්ය වේ: RNA 3 කට cDNA 2 ක්, RNA 6 ට cDNA 4 ක් ලැබේ, එබැවින් කොපමණ නියැදියක් පූරණය කළත් ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව සාපේක්ෂව ස්ථායී වේ.ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව අස්ථායී සහ ඉහළ සාන්ද්රණය අවහිර වන තත්ත්වය දැකීමට අපට අවශ්ය නැත.
ඉතින්, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව ස්ථායී දැයි තහවුරු කරන්නේ කෙසේද?ක්රමය ඉතා සරලයි, ඔබට අවශ්ය වන්නේ සංසන්දනාත්මක පරීක්ෂණයක් පමණි: එකක් නම් RNA ද්රව්ය දෙගුණ කිරීමෙන් පසු cDNA වෙත ප්‍රතිවර්තනය කිරීම, සහ අනෙක cDNA වෙත ප්‍රතිවර්තනය කිරීමෙන් පසු දෙගුණ කිරීම තනුක කිරීම, පසුව ලබාගත් බෑවුම අනුකූලද යන්න බැලීමට qPCR කරන්න.ඉහළම ශිෂ්‍යයෙකු ලෙස, ඔබ එය තත්පර කිහිපයකින් තේරුම් ගත යුතුය.පහත දැක්වෙන පරිදි:
ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව ස්ථායීද යන්න පරීක්ෂා කිරීම සඳහා RNA සහ cDNA තනුක කිරීම
ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ කට්ටලය
පරිපූර්ණ ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR හි විශිෂ්ට ප්රතිලෝම පිටපතක් සහ කට්ටලයක් ඇත්තේ කෙසේද?ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් ප්‍රභවයට අනුව දළ වශයෙන් වර්ග දෙකකට බෙදා ඇත, AMV හෝඑම්-එම්එල්වී, සහ ඔවුන්ගේ කාර්ය සාධනය වගුවේ දක්වා ඇති ආකාරයටම වේ.
RNase H ක්රියාකාරිත්වය
RNase H යනු Ribonuclease H, චීන නාමය ribonuclease H වේ, එය DNA-RNA දෙමුහුන් දාමයේ RNA විශේෂයෙන් ජල විච්ඡේදනය කළ හැකි endoribonuclease වේ.RNase H හට තනි කෙඳි හෝ ද්විත්ව නූල් DNA හෝ RNA වල ඇති ෆොස්ෆොඩීස්ටර් බන්ධන ජල විච්ඡේදනය කළ නොහැක, එනම් එයට තනි නූල් හෝ ද්විත්ව නූල් DNA හෝ RNA දිරවිය නොහැක.cDNA හි දෙවන තන්තු සංශ්ලේෂණය කිරීමේදී බහුලව භාවිතා වේ.
ඒක අමුතු දෙයක්.අපි කියන්නේ ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේසයේ RNase H ක්‍රියාකාරකම් ඇති බවත්, ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් හි RNase H අඩංගු බවත්, RNase H ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් වලින් වෙන් කිරීමට නොහැකි විය හැකි බවත්, සමහර විට ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් හි ඇතැම් කණ්ඩායම්වල අනුකූලතාවය නිසා මෙම ක්‍රියාකාරකම ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම නිසා ඇති වන බවයි.
එබැවින්, AMV හි ඉහළ ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව කුමක් වුවත්, එහි RNase H ක්‍රියාකාරකම් cDNA අස්වැන්න අඩු කරයි.ඇත්ත වශයෙන්ම, ප්රතික්රියාකාරක නිෂ්පාදකයින් cDNA අස්වැන්න වැඩි කිරීම සඳහා හැකිතාක් ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් හි RNase H ක්‍රියාකාරකම් ඉවත් කිරීම සඳහා ඔවුන්ගේ නිෂ්පාදන නිරන්තරයෙන් ප්‍රශස්ත කරයි.
උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය
විවිධ උෂ්ණත්වවලදී RNA හි ද්විතියික ව්යුහය
විවිධ උෂ්ණත්වවලදී RNA හි ද්විතියික ව්යුහය සඳහා ඉහත රූපය බලන්න, සහ නිශ්චිත උෂ්ණත්ව සහ ලුණු සාන්ද්‍රණ තත්ව යටතේ ඉලක්කගත කොටසෙහි ද්විතියික ව්යුහය තීරණය කිරීමට mFold සබැඳි මෙවලම භාවිතා කරන්න.55°C දී, RNA හි ද්විතියික ව්යුහය තවමත් ඉතා සංකීර්ණ වන අතර, ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් ක්‍රියා කළ නොහැකි අතර, 65°C දක්වා ද්විතියික ව්යුහය සම්පූර්ණයෙන් විසඳිය නොහැකි අතර, AMV සහ M-MLV වල ප්‍රශස්ථ උෂ්ණත්වය මෙම උෂ්ණත්වයට වඩා බෙහෙවින් අඩුය.
කුමක් කරන්න ද?ද්විතියික ව්යුහය යනු අච්චුවේම අනුපූරක යුගලනය වන අතර, එය ප්‍රයිමර් සහ ප්රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් සහ අච්චුව අතර ප්‍රබල තරඟයක් ඇති කරයි, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස අඩු E සහ දුර්වල පුනරාවර්තන හැකියාව වැනි ගැටළු මාලාවක් ඇති වේ.
කුමක් කරන්න ද?හැකිතාක් දුරට පමණක් ඇනීමේ උෂ්ණත්වය වැඩි කරන්න.
බොහෝ ප්රතික්රියාකාරක නිෂ්පාදකයින් ජාන ඉංජිනේරු විද්‍යාව හරහා ඔවුන්ගේ ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම වැඩි දියුණු කරයි.සමහරක් Jifan සහ Aidelai වැනි ප්රතික්රියා උෂ්ණත්වය වැඩි කරන අතර සමහරක් එන්සයිම සහ RNA සැකිල්ල අතර සම්බන්ධය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා RNase H එන්සයිමයේ ක්‍රියාකාරී කාණ්ඩය ඉවත් කරයි.ඉහළ සම්බන්ධතාවයට ද්විතියික ව්යුහය තරඟකාරී ලෙස මිරිකා හැරීමට සහ සුමට ලෙස කියවිය හැකි අතර, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාවද බෙහෙවින් වැඩි දියුණු කළ හැකිය.
ප්රධාන කරුණ: ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාවයේ (එන්සයිම කාර්යක්ෂම පමණක් නොව ස්ථායී ද විය යුතුය), පටවා ඇති සාම්පල ප්‍රමාණයට වඩා ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම වඩාත් වැදගත් වේ, එය විශේෂයෙන් විශාල පරිමාණයේ ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR නොවේ නම්, එය කිසිසේත් කළ නොහැකි වනු ඇත.බහු cDNA.
විවිධ නිෂ්පාදකයින් ද අනුකූලතාව ලුහුබැඳීම සඳහා යම් උත්සාහයක් ගෙන ඇත.උදාහරණයක් ලෙස, බොහෝ සමාගම් දැන් විකිණීම සඳහා සම්මත කට්ටලයක් ලෙස ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීම ඇසුරුම් කර ඇත, එය හොඳ තේරීමකි.
උදාහරණයක් ලෙස, Foregene's RT Easy Series කට්ටල:
RT Easy I (පළමු නූල් cDNA සංශ්ලේෂණ කට්ටලය සඳහා ප්රධාන ප්‍රිමික්ස්)
MIQE (5) - ඉලක්කගත ජාන තොරතුරු
ඉහත රූපය පැහැදිලි කරයි
1. මෙම ජානය නැවත නැවත කරන ලද අත්හදා බැලීම් සඳහා ඵලදායිද යන්න සාමාන්යයෙන් නැවත නැවත කරන ලද පරීක්ෂණ මගින් තහවුරු කර ගත හැක.
2. ජාන හැඳුනුම්පත, ඔබ දන්නවා.
3. ජාන දිග, ඉලක්කගත ජානයේ සම්පූර්ණ දිග අනිවාර්යයෙන්ම ගැටලුවක් නොවේ.ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීමේදී, වඩා හොඳ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයක් සහතික කිරීම සඳහා ඇම්ප්ලිකන් දිග 80-200bp අතර බව සහතික කර ගන්න.
4. අනුක්‍රමික පිපිරුම් සැසඳීමේ තොරතුරු, විශේෂිත නොවන විස්තාරණය වැළැක්වීම සඳහා ඉලක්කගත ජානය ජාන බැංකුවේ සැසඳිය යුතුය.
5. pseudogenes පැවතීම.pseudogene යනු සාමාන්ය ජානයකට සමාන නමුත් එහි සාමාන්ය ක්රියාකාරිත්වය නැති වන DNA අනුපිළිවෙලකි.එය බොහෝ විට යුකැරියෝටේ බහු ජාන පවුල තුළ පවතී.එය සාමාන්යයෙන් ψ මගින් නිරූපණය කෙරේ.එය ක්‍රියාකාරී නොවන ජානමය DNA පිටපතක් වන ජෙනෝමය තුළ කේතීකරණ ජාන අනුක්‍රමයට බෙහෙවින් සමාන ය., සාමාන්යයෙන් පිටපත් කර නොමැති අතර පැහැදිලි කායික අර්ථයක් නොමැත.
6. exons සහ intron වලට සාපේක්ෂව ප්‍රයිමර් වල පිහිටීම.මුල් වසරවලදී, අපි DNA දූෂණය පිළිබඳ ගැටළුව විසඳන විට, අපි බොහෝ විට ප්‍රයිමර්, එක්සෝන සහ ඉන්ට්‍රෝන වල ස්ථාන කෙරෙහි අවධානය යොමු කළ අතර සාමාන්යයෙන් DNA විස්තාරණය වළක්වා ගැනීම සඳහා අභ්‍යන්තරය හරහා ප්‍රයිමර් සැලසුම් කිරීම සලකා බැලුවෙමු.කරුණාකර පහත රූපය බලන්න: කළු පැහැයෙන් අභ්‍යන්තරය නියෝජනය කරයි, විවිධ නිල්වන් එක්සෝන නියෝජනය කරයි, රෝස පැහැයෙන් පොදු ප්‍රයිමර් නියෝජනය කරයි, සහ දීප්තිමත් රතු පැහැයෙන් අභ්‍යන්තරය විහිදෙන ප්‍රයිමර් නියෝජනය කරයි.
ක්‍රමානුකුල, කිසිදා සත්‍ය නොවේ
මෙය කෙතරම් පරිපූර්ණ සැලැස්මක් ලෙස පෙනේ, නමුත් ඇත්ත වශයෙන්ම, බොහෝ අවස්ථාවලදී, ට්‍රාන්ස්-ඉන්ට්‍රෝන් ප්‍රයිමර් සිතන තරම් ඉන්ද්‍රජාලික නොවන අතර ඒවා විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක් ද ඇති කරයි.එබැවින් DNA දූෂණය වැළැක්වීම සඳහා හොඳම ක්රමය වන්නේ DNA සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් කිරීමයි.
7. අනුකූලතා අනාවැකිය.මෙම උදාහරණය නැවත භාවිතා කරමින්, නිශ්චිත උෂ්ණත්වයකදී සහ ලුණු සාන්ද්‍රණයකදී ඉලක්කගත කොටසෙහි ද්විතියික ව්යුහය තීරණය කිරීමට mFold ඔන්ලයින් මෙවලම භාවිතා කරන්න.
විවිධ උෂ්ණත්වවලදී RNA හි ද්විතියික ව්යුහය
ද්විතියික ව්යුහය යනු අච්චුවෙහිම අනුපූරක යුගලනය වන අතර, එය ප්‍රාථමිකය සහ අච්චු යුගලය අතර ප්‍රබල තරඟයකට තුඩු දෙනු ඇති අතර, ප්රාථමික බන්ධනය වීමේ අවස්ථා අඩු වන අතර, අඩු E සහ දුර්වල පුනරාවර්තන හැකියාව වැනි ගැටළු මාලාවක් ඇති කරයි.මෘදුකාංග පුරෝකථනය හරහා, ද්විතියික ව්යුහයේ ගැටලුවක් නොමැති නම්, එය විශිෂ්ට වනු ඇත.තිබේ නම්, අපගේ පසු විපරම් ලිපිය මෙම ගැටළුව විසඳන්නේ කෙසේදැයි විශේෂයෙන් සාකච්ඡා කරනු ඇත.
MIQE (6)-qPCR ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ
ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR සඳහා, ඔබ දිනපතා අරගල කරන පළමු දෙය RNA නිස්සාරණය වන අතර දෙවන දෙය ප්රාථමික නිර්මාණය විය හැකිය.
පළමුවෙන්ම, අපි තවමත් MIQE පිරික්සුම් ලැයිස්තුවට අනුව ප්‍රයිමර් නිර්මාණය පිළිබඳ නීති පරීක්ෂා කරන්නෙමු.එය කෙතරම් සරලද යත් ජරාවට සිනාසිය හැකි අතර අපට එය එක වාක්‍යයකින් අවසන් කළ හැකිය: ප්‍රයිමර් පරීක්ෂණයේ අනුපිළිවෙල සහ පිහිටීම සහ වෙනස් කිරීමේ ක්රමය සොයා ගන්න.ප්රාථමික පිරිසිදු කිරීමේ ක්රමය සඳහා, ප්රාථමික සංස්ලේෂණය වර්තමානයේ ඉතා ලාභදායී වේ, qPCR PAGE සහ ඉහත පිරිසිදු කිරීමේ ක්රම සඳහා සුදුසු වන අතර සංස්ලේෂණ උපකරණයේ තොරතුරු වැදගත් නොවේ.බොහෝ අය දශක ගණනාවක් තිස්සේ ප්‍රයිමර් කරමින් සිටින අතර සංස්ලේෂකය ABI3900 බව නොදනී.
ප්‍රයිමර් නිර්මාණයේ මූලධර්ම සම්බන්ධයෙන්, ඔබට ඒවා කටපාඩමින් කටපාඩම් කිරීමට අවශ්ය නැත, මන්ද බොහෝ ප්‍රයිමර් නිර්මාණ මෘදුකාංග හෝ මාර්ගගත මෙවලම් මෙම ගැටළු (නිර්දේශිත මාර්ගගත මෙවලම් primer3.ut.ee/) බලා ගත හැකි අතර, ප්‍රයිමර් නිර්මාණයෙන් 99.999% ක් අතින් සිදු නොවේ.
ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කිරීමෙන් පසු පහත කරුණු පරීක්ෂා කරන්න:
1. 3′ අවසානයට ආසන්නව සැලසුම් ප්‍රයිමර්: cDNA පළමු-තන්තු සංස්ලේෂණය සඳහා ඔලිගෝ dT ප්‍රයිමර් භාවිතා කිරීමේදී, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව සහ RNA අඛණ්ඩතාව සැලකිල්ලට ගනිමින්, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා සැලසුම් කරන ලද ප්‍රයිමර් 3′ අන්තයට ආසන්නව නිර්මාණය කළ යුතුය.පහත පරිදි පැහැදිලි කිරීමට පින්තූරයක් භාවිතා කරන්න (මෙය තේරුම් ගැනීමට ක්රමයක් නොමැත):
ප්‍රයිමර් 3′ අන්තයට ආසන්නව නිර්මාණය කළ යුත්තේ ඇයි, එය සත්‍ය නොවිය යුතුය
2. TM අගය: Tm අගය 55-65°C වේ (එක්සෝනියුක්ලීස් ක්රියාකාරිත්වය 60°C දී ඉහළම බැවින්), GC අන්තර්ගතය 40%-60% වේ.
3. BLAST: ජෙනෝමයේ නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය වැළැක්වීම සඳහා, අතිරේක සත්‍යාපනය සඳහා Blast භාවිතා කළ යුතුය.
MIQE(7)-qPCR ක්‍රියාවලිය
1. qPCR කට්ටලය
MIQE හි අවශ්‍යතා අනුව, PCR ප්රතික්රියා පද්ධතියේ වින්‍යාසය, කුමන කට්ටලය භාවිතා කරන්නේද, නිෂ්පාදකයා කවුද, ප්රතික්රියා පද්ධතිය කෙතරම් විශාලද, ඩයි ක්රමය හෝ පරීක්ෂණ ක්රමය භාවිතා කරන්නේද, PCR වැඩසටහන් සැකසුම් ඇතුළුව සම්පූර්ණ ප්රතික්රියා තත්වයන් අපි ලිපියේ පැහැදිලිව විස්තර කළ යුතුය.කට්ටලය තෝරාගෙන ඇති තාක් කල්, ඉහත තොරතුරු මූලික වශයෙන් තීරණය කර ඇති බව ප්රවීණ රියදුරන් නිසැකවම සොයා ගනු ඇත.
වර්තමානයේ, ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR කට්ටල නිෂ්පාදනය සහ නිෂ්පාදනය ඉතා පරිණත තාක්ෂණයකි.ඔබ අතිශයින් නරක නිෂ්පාදකයින් තෝරා නොගන්නා තාක්, ගැටළු ඇතිවීමේ සම්භාවිතාව ඉහළ නැත, නමුත් අපට තවමත් ඔබ සමඟ කරුණු කිහිපයක් බෙදා ගැනීමට අවශ්‍යයි:
Hot-start Taq එන්සයිමය:PCR හි වැදගත්ම කොටස වන්නේ උණුසුම්-ආරම්භක Taq එන්සයිමයයි.වෙළඳපොලේ ඇති උණුසුම්-ආරම්භක එන්සයිම සාමාන්යයෙන් වර්ග දෙකකට බෙදා ඇත, එකක් රසායනිකව වෙනස් කරන ලද උණුසුම්-ආරම්භක එන්සයිමයකි (ඔබට එය පැරෆින් කාවැද්දීම ලෙස සිතාගත හැකිය), අනෙක ප්රතිදේහ වෙනස් කිරීම සඳහා (ප්‍රතිදේහජනක-ප්රතිදේහ බන්ධනය) උණුසුම්-ආරම්භක එන්සයිමයකි.රසායනික වෙනස් කිරීම උණුසුම්-ආරම්භක එන්සයිමවල මුල් ක්රමයකි.නිශ්චිත උෂ්ණත්වයකට ළඟා වූ විට, එන්සයිම එහි ක්රියාකාරිත්වය මුදා හරිනු ඇත.ප්රතිදේහ වෙනස් කරන ලද උණුසුම්-ආරම්භක එන්සයිම එන්සයිමයේ ක්රියාකාරිත්වය අවහිර කිරීම සඳහා ජීව විද්යාත්මක ක්රම භාවිතා කරයි.යම් උෂ්ණත්වයකට ළඟා වූ විට, ප්රතිදේහ ප්‍රෝටීනයක් ලෙස ක්‍රියා විරහිත කර අක්‍රිය වන අතර එන්සයිම ක්රියාකාරිත්වය ක්‍රියාත්මක වේ.
කෙසේ වෙතත්, මෙයින් ඇති ප්රයෝජනය කුමක්ද?මෙයයි, ප්රතිදේහ නවීකරණය කරන ලද එන්සයිම මුදා හැරීමේ ක්රියාකාරිත්වය රසායනිකව වෙනස් කරන ලද එන්සයිම වලට වඩා වේගවත්, එබැවින් සංවේදීතාව අනුව ප්රතිදේහ වෙනස් කළ එන්සයිම වලට සුළු වාසියක් ඇත, එබැවින් මූලික වශයෙන් රසායනිකව වෙනස් කරන ලද එන්සයිම වෙළඳපොලේ කට්ටලවල නොමැත.තිබේ නම්, මෙම නිෂ්පාදකයාගේ තාක්ෂණය තවමත් සහස්රයේ යුගයේ සිරවී ඇත.
මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය:PCR ප්රතික්රියාවේ දී මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය ඉතා වැදගත් වේ.සුදුසු මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය Taq එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් මුදා හැරීම ප්‍රවර්ධනය කළ හැක.සාන්ද්රණය ඉතා අඩු නම්, එන්සයිම ක්රියාකාරිත්වය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වනු ඇත;සාන්ද්රණය ඉතා ඉහළ නම්, එන්සයිම උත්ප්‍රේරක විශේෂිත නොවන විස්තාරණය වැඩි දියුණු කරනු ලැබේ.මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය ප්‍රයිමර් ඇනීල් කිරීම, අච්චුවේ දියවන උෂ්ණත්වය සහ PCR නිෂ්පාදන කෙරෙහි ද බලපාන අතර එමඟින් විස්තාරණය කළ කොටස්වල අස්වැන්න කෙරෙහි බලපායි.මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය සාමාන්යයෙන් 25mM දී පාලනය වේ.ඇත්ත වශයෙන්ම, හොඳ කට්ටලයක් සඳහා, මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය හොඳින් පාලනය කළ යුතුය.සමහර වෙළෙන්දෝ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයට මැග්නීසියම් අයන චෙලේටින් කාරකයක් එකතු කරන අතර එමඟින් මැග්නීසියම් අයන සාන්ද්රණය ස්වයංක්‍රීයව සකස් කිරීමේ බලපෑම ලබා ගත හැක.
ප්රතිදීප්ත සායම් සාන්ද්රණය:අපි සාමාන්යයෙන් භාවිතා කරන SYBR ග්‍රීන් වන ප්රතිදීප්ත සායම් ප්රධාන වශයෙන් ප්‍රතිදීප්තතාව උත්පාදනය කරන්නේ ද්විත්ව කෙඳි DNA වල කුඩා වලයට බැඳීමෙනි, මන්ද ඩයි ද්විත්ව නූල් DNA වලට බන්ධනය වීම විශේෂිත නොවන බැවිනි. පසුබිම් සංඥාව.
PS: එහි ආලෝකයට සංවේදී ගුණාංග නිසා, වෙළඳපොලේ ඇති නිෂ්පාදන සාමාන්යයෙන් දුඹුරු පාරාන්ධ කේන්ද්‍රාපසාරී නල වල ඇසුරුම් කර ඇත (පහත පින්තූරයේ පෙන්වා ඇති පරිදි).කෙසේ වෙතත්, මෙය ගැටලුවකට මුහුණ දෙනු ඇත.නියැදීමේදී දියර උරා බොනවාදැයි බැලීම අපහසුය.මේ සම්බන්ධයෙන්, Qingke ඇත්තෙන්ම වඩාත්ම පරිශීලක-හිතකාමී වේ (පහත පින්තූරයේ පෙන්වා ඇති පරිදි), සහ විනිවිද පෙනෙන නළය පාරාන්ධ ටින් බෑගයක ඇසුරුම් කර ඇත.ඉන්පසු ආලෝකය සහ නියැදීමෙන් වැළකී සිටීමේ පහසුව සැලකිල්ලට ගනිමින් එය ටින් බෑගයකට දමන්න.ඔබ නිවැරදි නිෂ්පාදන අංකය තෝරාගත යුතුය.TSE204 යනු සුපිරි පිරිවැය-ඵලදායී පැවැත්මක් වන අතර, මට තණකොළ සිටුවීමට අවශ්ය වේ.
ප්රතිදීප්ත සායම් සාන්ද්රණය ද ඉතා වැදගත් වේ.සාන්ද්රණය ඉතා අඩු නම්, වර්ධක වක්රය පසු අවධියේදී ඉහළ නොයන අතර එය පරිපූර්ණ නොවේ;සාන්ද්රණය ඉතා ඉහළ නම්, එය ශබ්ද බාධා ඇති කරයි.ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR ප්රධාන වශයෙන් CT අගය මත රඳා පවතින බැවින්, ප්රතිදීප්ත සායම් සාන්ද්රණය නිසි ලෙස සකසා නොමැති නම්, අඩු ලක්ෂ්‍යය ඉහළ ලක්ෂ්‍යයට වඩා හොඳය.ඇත්ත වශයෙන්ම, සුදුසු සායම් සාන්ද්රණය හොඳම වේ.
ROX: හොඳින් ළිං ප්රතිදීප්ත සංඥා දෝෂ නිවැරදි කිරීමට ROX ඩයි වර්ග භාවිතා කරයි.සමහර උපකරණ නිෂ්පාදකයින්ට ක්රමාංකනය අවශ්ය වන අතර අනෙක් අය එසේ නොවේ.උදාහරණයක් ලෙස, Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR විස්තාරණ උපකරණ භාවිතය සඳහා සාමාන්යයෙන් 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus ඇතුළුව ක්රමාංකනය අවශ්ය වේ. සාමාන්ය කට්ටල උපදෙස් එය විස්තර කරයි.
Foregene's qPCR Mix හි ROX ඩයි ද අඩංගු වන අතර එය විවිධ මාදිලිවල භාවිතයට පහසු වේ.
දුර්වල හයිඩ්රජන් බන්ධන ප්රතිකාරය: දුර්වල හයිඩ්රජන් බන්ධන ප්රතිකාර කිරීම සාපේක්ෂව තාක්ෂණික කාරණයකි.බොහෝ කට්ටලවල අත්පොත් කිසිවක් කියවා නැත, නමුත් ඔවුන්ගෙන් කිසිවෙකු මෙම මාතෘකාව සඳහන් කර නැත.ඇත්ත වශයෙන්ම, එය ඉතා වැදගත් ය.භෂ්මවල සංයෝජනය ප්රධාන වශයෙන් හයිඩ්රජන් බන්ධනවල ශක්තිය මත රඳා පවතී.ශක්තිමත් හයිඩ්රජන් බන්ධන සාමාන්ය විස්තාරණය වන අතර දුර්වල හයිඩ්රජන් බන්ධන විශේෂිත නොවන විස්තාරණයකට මග පාදයි.දුර්වල හයිඩ්රජන් බන්ධන හොඳින් ඉවත් කළ නොහැකි නම්, විශේෂිත නොවන විස්තාරණය වැළැක්විය නොහැක.කතුවරයාගේ විෂය පථය තුළ, මෙම ගැටළුව හඳුනාගෙන ඇත්තේ සමාගම් කිහිපයක් පමණි.ඔබ කට්ටලය මිලදී ගන්නා විට, ඔබට තෝරා ගැනීමට අවශ්ය කට්ටලය සඳහා ඔබ මේ සම්බන්ධයෙන් විසඳුමක් සලකා බැලුවද යන්න සඳහන් කළ හැකිය.
ප්රතික්රියා පරිමාව: 20-50ul පද්ධතිය බහුලව භාවිතා වන අතර කුඩා පරිමාවන් දෝෂ ඇතිවීමට ඉඩ ඇත.සාමාන්යයෙන් කථා කිරීම, කට්ටල උපදෙස් PCR ප්රතික්රියා පරිමාවන් භාවිතා කිරීම නිර්දේශ කරනු ඇත.දක්ෂ නොවන්න සහ වියදම් ඉතිරි කර ගැනීමට කුඩා වෙළුම් භාවිතා කරන්න.ඉලක්කය.වෙළෙන්දන් විසින් නිර්දේශ කරන ලද පරිමාව ඇත්ත වශයෙන්ම පරීක්ෂාවට ලක් කර ඇති අතර, කුඩා පරිමාවන් නිසා ඇතිවන දෝෂ පිළිබඳ ගැටළුව විසඳා ගත නොහැකි විය හැකිය.
2. නල තහඩුවේ නිෂ්පාදකයා සහ ලිපි අංකය
ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR මූලධර්මය කවුරුත් දනිති.ප්රතිදීප්ත එකතු කිරීම ප්රධාන වශයෙන් PCR නල ආවරණ හරහා සිදු කෙරේ.PCR පරිභෝජන ද්රව්ය තෝරාගැනීමේදී, කරුණු දෙකක් කෙරෙහි අවධානය යොමු කරන්න: හොඳ ආලෝක සම්ප්රේෂණය සහ උපකරණය සඳහා සුදුසු වේ.සාමාන්යයෙන් කථා කරන විට, ප්රධාන ධාරාවේ වෙළඳ නාමවල පුවරු සහ ටියුබ් හොඳයි, නමුත් ඔබ අනුවර්තනය සම්බන්ධයෙන් ප්රවේශමෙන් තෝරා ගත යුතුය, එසේ නොමැතිනම් ඔබට උපකරණය භාවිතා කිරීමට නොහැකි වනු ඇත.
4. ඉහළ මට්ටමේ දැනුම
MIQE (8)—qPCR වලංගුකරණය
qPCR හි ප්‍රමුඛතාවය මෙයයි!ඒ තරම් වීරයෝ මෙතන වැල්ලට වැටිලා.ඇත්ත වශයෙන්ම, ඔබ වාසනාවන්ත විය හැකි අතර ඔබ අධ්‍යයනය කළ ජාන සරල බැවින් ඔබ සුළඟ දිගේ අයිස් ගුහාව හරහා පාවී ගියේය.qPCR හි සත්‍යාපන තොරතුරු දත්තවල විශ්වසනීයත්වය පරීක්ෂා කිරීමට අදහස් කෙරේ.අවශ්ය සත්‍යාපන තොරතුරු අපි පහත පරිදි ලැයිස්තුගත කරමු:
1.විශේෂතා පරීක්ෂණය
ඉලක්ක ජාන විස්තාරණයේ විශේෂත්වය විද්යුත් විච්ඡේදක පින්තූරය තනි කලාපයක් දැයි පරීක්ෂා කිරීම මගින් පරීක්ෂා කරනු ලැබේ;අනුපිළිවෙල තහවුරු කිරීම;උච්ච සිතියම තනි දැයි බැලීමට දියවන වක්රය;එන්සයිම ජීර්ණය තහවුරු කිරීම සහ වෙනත් ක්රම.
මෙන්න, අපි අවධානය යොමු කරන්නේ ටීඔහු වක්ර උණු කිරීමේ ක්රමය භාවිතා කරමින් විශේෂිත නොවන විස්තාරණය විශ්ලේෂණය කරයි.සාමාන්යයෙන් කථා කරන විට, අපි ප්‍රයිමර් නිර්මාණය කරන විට, නිෂ්පාදන ඛණ්ඩයේ ප්රමාණය 80-200bp පරාසයක තිබිය යුතු අතර, එමඟින් PCR නිෂ්පාදනයේ ද්රවාංක උෂ්ණත්වය 80-85 °C පරාසයක් බවට පත් කරයි.එබැවින්, විවිධ ශිඛර තිබේ නම්, වෙනත් විශේෂිත නොවන විස්තාරණ නිෂ්පාදන තිබිය යුතුය;උච්චය 80 ° C ට වඩා අඩු නම්, එය සාමාන්යයෙන් ප්රාථමික ඩයිමර් ලෙස සැලකේ;උච්චය 85 ° C ට වඩා වැඩි නම්, එය සාමාන්යයෙන් DNA දූෂණය හෝ විශාල කොටස්වල නිශ්චිත නොවන විස්තාරණයක් ලෙස සැලකේ.
සටහන: සමහර විට 80 ° C දී තනි උච්චයක් පමණක් පවතී.මෙම අවස්ථාවේදී, මෙම සංකල්පය පිළිපැදිය යුතුය.විස්තාරණ ප්රතිඵල සියල්ල ප්‍රයිමර් ඩයිමර් විය හැකිය.
සාමාන්ය ද්රවාංක වක්රය (විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක් නොමැති තනි උච්චය)
ගැටළු සහගත ද්රවාංක වක්රය (ව්‍යාජ කඳු මුදුන්වල නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය)
【නඩු විශ්ලේෂණය】
ප්රධාන උච්චයක් ඇත, නමුත් ප්රාථමික ඩිමර් බරපතල වේ
පහත රූපයේ ඇති තනි-උච්ච ද්රවාංක වක්රය පරිපූර්ණ අත්හදා බැලීමක් යැයි සිතමින් ඔබේ ඇස් පහසුවෙන් රැවටිය හැක, නමුත් ප්රතිඵලය සම්පූර්ණයෙන්ම වැරදියි.මෙම අවස්ථාවේදී, අපි දියවන උෂ්ණත්වය දෙස බැලිය යුතුය.උපරිම උෂ්ණත්වය සෙල්සියස් අංශක 80 ට අඩු වන අතර එය සම්පූර්ණයෙන්ම ප්රාථමික-ඩිමර් වේ.
ඉලක්ක ඛණ්ඩනයක් නැත, සියලුම ප්‍රයිමර් ඩිමර්
මෙන්න මල්ලිට නවත්තන්න බෑ.පහත පින්තූරයේ ඇත්තේ ජරා මිනිසෙක් මට එවූ ජංගම දුරකථනයකින් ගත් ඡායාරූපයකි.ඔහු භාවිතා කළ ප්රතික්රියාකාරක සියල්ලම කර්මාන්තයේ බහුලව භාවිතා වන වෙළඳ නාම වේ.ඔහු එක් T-උපසර්ග සන්නාමයකින් තවත් T-උපසර්ග සන්නාමයකට වෙනස් විය.මම හිතන්නේ ඔබ දැනටමත් එය අනුමාන කර ඇත.ජරා මිනිසා මට කෑගැසුවේය: “පළමු පින්තූරයේ භාවිතා කර ඇති ප්‍රතික්‍රියාකාරකය ඉතා හොඳයි, සහ උච්චය තනි ය.පසුව, ඔබ නිර්දේශ කළ ප්‍රතික්‍රියාකාරකය භාවිතා කිරීමෙන් පසු, එය මිශ්‍ර මුදුන් සහිත දෙවන පින්තූරයට සමාන වේ.ඔබ මාව අසරණ කළා."
ප්‍රස්ථාර දෙක වෙන් කරන්න.මුලින්ම බැලූ බැල්මට, එකකට තනි මුදුනක් ඇත, අනෙකට ද්විත්ව ශිඛරය ඇත.විකාර, තනි මුදුනක් ඇත්තෙන්ම හොඳයි.ඒක ඇත්තක්ද?
Dou E ට වඩා නරකයි, මම පහත පින්තූරයේ පින්තූර දෙක දැම්මොත්, ඔබට වහාම වැටහෙනු ඇත.ඇත්ත වශයෙන්ම, මේ ආකාරයේ පින්තූරයක් නිසා අපි පහසුවෙන්ම අංශභාගය වෙමු.ප්රවේශමෙන් විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් පසුව, අපි සොයා ගත්තේ: පළමු රූපයේ උපරිමය 75 ° C වන අතර එය සම්පූර්ණයෙන්ම ප්රාථමික ඩිමර් වේ;දෙවන රූපයේ උච්චය 75 ° C සහ 82 ° C දී දිස් වේ, අවම වශයෙන් එහි නිෂ්පාදනය පෙනේ.
සිසුන්ගේ ප්‍රතිපෝෂණවල පින්තූර
එබැවින් මූලික ගැටළුව ප්‍රතික්‍රියාකාරකවල ගැටලුව නොව ප්රාථමික නිර්මාණයේ ගැටලුවයි.ඒ අතරම, සමහර විශාල වෙළඳ නාම යකඩ ගුණාත්මක නොවන බව ද එය සනාථ කරයි, එය මගේ සහෝදරයා කලින් පැවසූ දේ ද සනාථ කරයි: එය ඔබේ ලිපියට සහාය වන්නේ ප්රතික්රියාකාරක වෙළඳ නාමය නොවේ.ප්රතික්රියාකාරක සන්නාමයට මුක්කු ගැසුවේ ඔබේ ලිපියයි.නිකමට හිතන්න, ජරා ප්රතික්රියාකාරක වෙනස් නොකළේ නම්, වැරදි දත්ත ජර්නලයට යවනු ඇත, සහ සිදුවන්නේ කුමක්ද යන්න ඛේදවාචකයක් වනු ඇත.
2. හිස් පාලනයේ Ct අගය
පැහැදිලි කරන්න එපා, හිස් පාලනයට Ct අගයක් තිබේ නම්, එය දූෂණය නොවේද?කෙසේ වෙතත්, Ct අගයක් ඇත්තේ කුමන හිස් පාලනයටදැයි ඔබ තවමත් තේරුම් ගත යුතුය.එය NTC නම්, එයින් අදහස් වන්නේ ප්රතික්රියාකාරක දූෂණය වැනි විදේශීය DNA ඇති බවයි.එය NRT නම්, එයින් අදහස් වන්නේ නිස්සාරණය කරන ලද RNA වල DNA දූෂණය ඇති බවයි.
3. සම්මත වක්රය
බෑවුම සහ ගණනය කිරීමේ සූත්රය ඇතුළුව, PCR කාර්යක්ෂමතාව සූත්රය හරහා ගණනය කළ හැක.පරිපූර්ණ පරීක්ෂණයක් සඳහා සම්මත වක්‍රයේ බෑවුම 3.32 ට ළඟා වීමටත් R² 0.9999 ට ළඟා වීමටත් අවශ්ය වේ.
4. රේඛීය ගතික පරාසය
ප්රතික්රියාවේ ගතික පරාසය රේඛීය වේ.සම්මත වක්රය උත්පාදනය කිරීමට භාවිතා කරන අච්චුවට අනුව, ගතික පරාසයට අවම වශයෙන් සාන්ද්‍රණ අනුක්‍රමික 5ක් වත් ඇතුළත් විය යුතු අතර, ඉහළ සාන්ද්‍රණ අනුක්‍රමික සහ අඩු සාන්ද්‍රණ අනුක්‍රමයේදී Ct අගයන් වෙනස් කිරීම කෙරෙහි අවධානය යොමු කරන්න.
5. හඳුනාගැනීමේ නිරවද්‍යතාවය
qPCR ප්රතිඵලවල වෙනස්වීම්, එනම් දුර්වල පුනරාවර්තන හැකියාව, එනම් දුර්වල නිරවද්‍යතාවය, උෂ්ණත්වය, සාන්ද්රණය සහ ක්රියාකාරිත්වය ඇතුළු බොහෝ සාධක නිසා ඇතිවේ.පිටපත් අංකය අඩු වන විට qPCR නිරවද්‍යතාව සාමාන්යයෙන් පාලනය කළ නොහැකි වේ.පර්යේෂණාත්මක විචලනය තුළ ඉතා මැනවින්, මෙම තාක්ෂණික විචලනය ජීව විද්යාත්මක විචලනයට වඩා වෙනස් විය යුතු අතර, ජීව විද්යාත්මක අනුරූ වලට කණ්ඩායම් හෝ ප්රතිකාර අතර qPCR ප්රතිඵලවල සංඛ්‍යානමය වෙනස්කම් සෘජුවම ආමන්ත්‍රණය කළ හැකිය.විශේෂයෙන්ම රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණ සඳහා, අඩවි සහ ක්‍රියාකරුවන් හරහා හොඳම අන්තර්-විශ්ලේෂණ නිරවද්‍යතාවය (පුනරාවර්තනය වීමේ හැකියාව) වාර්තා කළ යුතුය.
6. හඳුනාගැනීමේ කාර්යක්ෂමතාව සහ LOD (මල්ටිප්ලෙක්ස් qPCR හි)
අනාවරණය වූ ධනාත්මක සාම්පලවලින් 95% ක අඩුම සාන්ද්රණය LOD වේ.වෙනත් වචන වලින් කිවහොත්, ඉලක්කගත ජාන අනුරූ කට්ටලයක් තුළ අඩංගු LOD සාන්ද්රණය අසාර්ථක ප්‍රතික්‍රියාවලින් 5% නොඉක්මවිය යුතුය.මල්ටිප්ලෙක්ස් qPCR විශ්ලේෂණය සිදු කරන විට, විශේෂයෙන් ලක්ෂ්‍ය විකෘති හෝ බහුරූපීතාවයන් එකවර හඳුනා ගැනීම සඳහා, බහුවිධ ඉලක්ක කොටස්වල නිරවද්‍යතාවය එකම නළය තුළ සම්මුතියක් නොමැති බවට බහුවිධ qPCR සාක්ෂි සැපයීමට අවශ්ය වේ, බහු හඳුනාගැනීම සහ තනි නල හඳුනාගැනීමේ කාර්යක්ෂමතාව සහ LOD සමාන විය යුතුය.විශේෂයෙන් ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් යුත් ඉලක්ක ජාන සහ අඩු සාන්ද්රණය ඉලක්ක ජාන එකවර විස්තාරණය කරන විට, මෙම ගැටලුව කෙරෙහි අවධානය යොමු කළ යුතුය.
ගැටළු සහ විසඳුම්සාමාන්‍යයෙන් කිවහොත්, qPCR නිදොස්කරණයේදී බොහෝ විට ඇති වන ගැටලු පහත සඳහන් අංශ කෙරෙහි අවධානය යොමු කරයි:
· නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය
ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයේ දුෂ්කර තේරීම සහ ප්‍රයිමර්-ඩිමර් සමඟ ඇති කරදර
· ඇනීලිං උෂ්ණත්වය වැරදියි
· ද්විතියික ව්යුහය විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයට බලපායි
නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය
විශේෂිත නොවන විස්තාරණයසිදුවේ , ප්‍රයිමර් සැලසුම සුදුසු නොවේද යන්න සාමාන්යයෙන් සලකනු ලැබේ, නමුත් ඔබ ප්‍රයිමර් වෙනස් කිරීමට ඉක්මන් නොවන්නේ නම්, ඔබට පළමුව පහත ක්රම උත්සාහ කළ හැකිය (මූලධර්මය ද අමුණා ඇත):
· නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය වැඩි කරන්න - දුර්වල හයිඩ්රජන් බන්ධන පවත්වා ගැනීමට නොහැකි වීමට උත්සාහ කරන්න;
· කෙටි කිරීම සහ දිගු කිරීමේ කාලය - දුර්වල හයිඩ්රජන් බන්ධනවල අවස්ථාව අඩු කිරීම;
· ප්රාථමික සාන්ද්රණය අඩු කිරීම - අතිරික්ත ප්‍රයිමර් සහ ඉලක්ක නොවන කලාප බන්ධනය වීමේ අවස්ථාව අඩු කිරීම;
අඩු විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව
විශේෂිත නොවන විස්තාරණයට ප්රතිවිරුද්ධ තත්ත්වය - අඩු විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව , සහ අඩු විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සමඟ කටයුතු කිරීමේ ක්‍රියාමාර්ග ප්රතිවිරුද්ධ වේ:
· ඇනීම් සහ දිගු කිරීමේ කාලය දිගු කරන්න;
·පියවර තුනක PCR වෙත වෙනස් කිරීම සහ ඇනලීම් උෂ්ණත්වය අඩු කිරීම;
· ප්රාථමික සාන්ද්රණය වැඩි කරන්න;
Ps: 90 දශකයේ උපත ලද බොහෝ උපාධිධාරී සිසුන් අත්හදා බැලීම් දෝශ නිරාකරණය කරන්නේ කෙසේදැයි අධ්‍යයනය කිරීමට අකමැති වන අතර, කට්ටලය මඟින් ගැටලුව සම්පූර්ණයෙන්ම විසඳා ගත හැකි යැයි බලාපොරොත්තු වේ (උපාධියෙන් පසු පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන කිරීමට ප්රතික්රියාකාරක සමාගමකට යාමට අවශ්ය නම්), ඇත්ත වශයෙන්ම, ප්රතික්රියාකාරක නිෂ්පාදකයින් ද මේ ආකාරයෙන් සිතමි, එය මෝඩකමක් යැයි මම බලාපොරොත්තු වෙමි. දුර්වල H-බන්ධන අවශෝෂණ සාධක.ගැටලුව පහසුවෙන් විසඳා ගැනීමට, දුර්වල හයිඩ්රජන් බන්ධන අවශෝෂණය කරන සාධකයක් තිබේදැයි බැලීමට මෝඩයන් තවමත් ප්රතික්රියාකාරක සමාගමේ හැඳින්වීම කියවිය යුතුය.
ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයේ දුෂ්කර තේරීම සහ ප්‍රයිමර්-ඩිමර් සමඟ කරදර
ක්රමය 1: සාමාන්යයෙන් කිවහොත්, qPCR සඳහා කට්ටල උපදෙස් නිර්දේශිත පද්ධති සහ නිර්දේශිත ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයන් ඇත.
ක්රමය 2: ප්රාථමික සාන්ද්රණය අනුක්‍රමණය සැකසීමෙන් නිදොස් කිරීම.පහත පින්තූරය නිදර්ශනය කිරීම සඳහා සමාගමකින් සොරකම් කර ඇත.පහත රූපයේ දැක්වෙන්නේ ප්රාථමික සාන්ද්‍රණ ශ්‍රේණි තුනක් (100nM, 250nM, 500nM) සහ සැකිලි සාන්ද්‍රණ ශ්‍රේණි හතරක් (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) සමඟින් සාදන ලද ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක ප්රතිඵලය.පර්යේෂණාත්මක ප්රතිඵලවල Ct අගය පහත පරිදි සැලසුම් කර ඇත:
ප්රාථමික සාන්ද්රණය තෝරාගැනීම පහත පරිදි පේළියකට එක් එක් ප්රාථමික සාන්ද්රණය ඒකාබද්ධ කරන්න:
ප්රාථමික සාන්ද්රණය තේරීම පැහැදිලිය, 100nM සහ 250nM ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයේ රේඛීය සම්බන්ධතාවය වඩා හොඳ වන අතර 500nM හි ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයේ රේඛීය සම්බන්ධතාවය සාපේක්ෂව දුර්වල වේ.100nM සහ 250nM වලදී, 250nM හි Ct අගය සාපේක්ෂව කුඩා වේ, එබැවින් ප්‍රශස්ත ප්රාථමික සාන්ද්රණය 250nM වේ.සාමාන්යයෙන් දැඩි ප්රාථමික-ඩිමර් ද්රවාංක වක්රය තුළ දැකිය හැක.සැලසුම් කරන ලද ප්‍රයිමර් වලට ප්‍රයිමර්-ඩිමර් වළක්වා ගත නොහැකි නම් කුමක් කළ යුතුද?
ක්රමය 3: ප්‍රයිමර් ප්රමාණය අඩු කිරීම සහ ඇනෙලිං උෂ්ණත්වය වැඩි කිරීම (පැහැදිලි කිරීමට අවශ්ය නැත).
නිර්වින්දන උෂ්ණත්වයේ ආනුභවික අගය 60 ° C වේ.ඔබට නිසැක නොවේ නම්, වඩාත් සුදුසු උෂ්නත්වය තෝරා ගන්නේ කෙසේද?පිළිතුර ප්රාථමික සාන්ද්රණය තෝරාගැනීමට සමාන වේ -අනුක්‍රමික පරීක්ෂණය.ගැටලුව නිදර්ශනය කිරීම සඳහා Bio-rad සමාගමෙන් පින්තූරයක් ගන්න.නිශ්චිත ඉලක්ක ඛණ්ඩයක් විස්තාරණය කිරීම සඳහා, එක් එක් පුනරාවර්තන තුනක් සහිත උෂ්ණත්ව අනුක්‍රමික අටක් සකසන්න, සහ ලබාගත් විස්තාරණ වක්රය පහත පරිදි වේ:
නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය තෝරාගැනීම:
·70°C, 69°C-මූලික වශයෙන්, ප්‍රයිමර් ඒකාබද්ධ කළ නොහැක, එබැවින් විස්තාරණයක් නොමැත.
· 67.3 ° C - ආරම්භයේ දී කුඩා විස්තාරණයක් ඇති අතර, Ct අගය සාපේක්ෂව විශාල වේ.
·64.5°C——Ct අගය අඩු වේ.
·60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, සහ 55.0°C දී Ct අගයන් මූලික වශයෙන් ස්ථායී වීමට නැඹුරු වූ නමුත් අවසාන ප්රතිදීප්ත අගයන් වෙනස් විය.
තෝරා ගන්නේ කෙසේද?මූලධර්මය: පළමු මූලධර්මය වන්නේ ඉහළ Ct අගයයි.එකම Ct අගය සඳහා, ඩයිමරීකරණය සහ විශේෂිත නොවන විස්තාරණය වැළැක්වීම සඳහා ඉහළ නිර්වින්දන උෂ්ණත්වයක් තෝරන්න.55 ° C දී ඉහළ ප්රතිදීප්ත අගයක් තිබුණද, එහි ඩයිමර් හෝ විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක් තිබිය හැකිය.
නමුත් ඔබ තරම් බුද්ධිමත් නම්, ඔබ නිසැකවම සිතනු ඇත: තාර්කිකව කථා කරන විට, PCR ප්‍රතික්‍රියාව ඉතා නිශ්චිත නම්, ප්රාථමික සාන්ද්රණය අවම අවශ්‍යතාවය ඉක්මවන තාක්, ප්රතිදීප්ත සායම් සහ dNTPs මෙන් ඉහළ සහ පහත් ලකුණු කිසිදු බලපෑමක් ඇති නොකළ යුතුය.ඇත්ත වශයෙන්ම, නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය නිසි ලෙස ප්‍රශස්ත කරන තාක් කල්, Ct අගය මත ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයේ බලපෑම ස්වභාවිකවම අවම වේ.
නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය නිසි ලෙස ප්‍රශස්ත කර ඇති අතර, CT මත ප්රාථමික සාන්ද්‍රණයේ බලපෑම අවම වනු ඇත.
ද්විතියික ව්යුහය විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයට බලපායි
ගැටලුව නිදර්ශනය කිරීම සඳහා අපි Bio-rad වෙතින් පින්තූරය ගනිමු.එය ද්විතියික ව්‍යුහයක් සහිත ජානයක් විස්තාරණය කිරීම සඳහා උෂ්ණත්ව අනුක්‍රමයක් ද නිර්මාණය කරයි.
ද්විතියික ව්යුහය මතු වේ
උෂ්ණත්ව අනුක්‍රමය අඩු වන විට, නිෂ්පාදන දර්ශනය වීමට පටන් ගන්නා අතර Ct අගය ඉදිරියට ගෙන යන අතර, අවම අගය 60.7 ° C වෙත ළඟා වන අතර, පසුව උෂ්ණත්ව අනුක්‍රමය අඩු වන විට Ct අගය විශාල වන බව දැකිය හැකිය.ප්රතිවිරුද්ධ ලෙස, උෂ්ණත්වය වැඩි වන විට, ද්විතියික ව්යුහය විවෘත වන අතර විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි වේ.නිශ්චිත උෂ්ණත්වයකට ළඟා වූ පසු, උෂ්ණත්වය වැඩි කිරීමෙන් විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි දියුණු කළ නොහැක.මෙම අවස්ථාවේදී ප්‍රයිමර් ස්ථාවර ලෙස ඒකාබද්ධ කළ නොහැකි බැවිනි.එබැවින්,අඩුම Ct අගය සහිත උෂ්ණත්වය සොයන්න, ද්විතියික ව්‍යුහ අච්චුව විස්තාරණය කිරීම සඳහා හොඳම උෂ්ණත්වය වන!ඇත්ත වශයෙන්ම, එය අවශ්ය නොවේ නම්, ප්රාථමික වෙනස් කිරීම සහ ද්විතියික ව්යුහය කලාපයෙන් වැළකී සිටීම වඩාත් සුදුසු බව ස්මාර්ට් මෝඩයන් දැන සිටිය යුතුය.
5. යෙදුම් මට්ටම
MIQE - දත්ත විශ්ලේෂණය
දත්ත විශ්ලේෂණය ප්රධාන වශයෙන් ලබා දෙන්නේ ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR උපකරණය මගිනි.පෙර ලිපියේ, අත්හදා බැලීමේ සැලසුමේදී පැහැදිලි කර ඇති හිස් පාලනය වැනි දත්ත විශ්ලේෂණ වැඩ රාශියක් සිදු කර ඇත.අභ්යන්තර යොමු ජාන, පුනරාවර්තන සංඛ්‍යා ආදිය පැහැදිලි කර ඇත., මෙහිදී අපි ප්රධාන වශයෙන් පැහැදිලි කරන්නේ qPCR යෙදුමයි.
qPCR බහුලව භාවිතා වන අතර, පර්යේෂණාත්මක සත්‍යාපනය සහ න්යෂ්ටික අම්ල රෝග විනිශ්චය වඩාත් බහුලව භාවිතා වන අවස්ථා වේ.
නිරපේක්ෂ ප්රමාණකරණය
ලොග් (ආරම්භක සාන්ද්රණය) චක්‍ර ගණන සමඟ රේඛීය සම්බන්ධතාවයක් ඇත.දන්නා ආරම්භක පිටපත් අංකයක් සහිත සම්මතයකින් සම්මත වක්රයක් ඇඳිය හැකිය, එනම් විස්තාරණ ප්රතික්රියාවේ රේඛීය සම්බන්ධතාවය ලබා ගත හැක.නියැදියේ Ct අගය අනුව, සාම්පලයේ සාන්ද්රණය ගණනය කළ හැකිය.ඇතුළත් කළ යුතු සැකිලි ප්රමාණය.
නිරපේක්ෂ ප්රමාණාත්මක ගණනය කිරීමේ ක්රමය
නිරපේක්ෂ ප්රමාණකරණය සම්මත වක්රය මත පදනම් විය යුතුය.සම්මත වක්රයක් සෑදීමට, සම්මතයක් අවශ්ය වේ.සාමාන්යයෙන්, ප්‍රමිතිය යනු ඉලක්කගත ජානය ක්ලෝන කිරීමෙන් ලබාගන්නා ප්ලාස්මිඩයකි.එය ප්ලාස්මිඩයක් වන්නේ ඇයි?වෘත්තාකාර ප්ලාස්මිඩ් DNA වඩාත්ම ස්ථායී වන බැවිනි.දෙගුණ කිරීමේ අනුපාතය (10 ගුණයකින් තනුක කිරීම) අනුව සම්මත නිෂ්පාදනය 5 සිට 6 දක්වා අනුක්‍රමයෙන් තනුක කරන්න, තනුක කිරීමේදී ඒකාකාරිත්වය කෙරෙහි අවධානය යොමු කරන්න.Ct අගය 15-30 අතර පහත වැටේවා.
සම්මත සූදානම
ඒ සමගම, පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදිය ද ඒ අනුව තනුක කළ යුතුය (තනුක සාධකය මතක තබා ගන්න), Ct අගය ද 15-30 අතර පහත වැටිය යුතුය.සම්මත නිෂ්පාදනය + පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදිය එකට යන්ත්රය මත තබා ඇත.ධාවනයෙන් පසු, සම්මත ද්රව්යය සමඟ සම්මත වක්රයක් සාදන ලද අතර, සාන්ද්රණය ගණනය කිරීම සඳහා පරීක්ෂා කළ යුතු සාම්පල සම්මත වක්රය තුළට ගෙන එන ලදී.
හෙපටයිටිස් බී වෛරස් HBV ප්රමාණනය සාමාන්ය නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණනයකි, එමඟින් රුධිරයේ මිලි ලීටර් 1 ක වෛරස් පිටපත් අංකය ගණනය කළ හැකිය.
පිටපත් අංකය ගණනය කිරීම
පරීක්ෂා කළ යුතු සාම්පල සාන්ද්රණය (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × තනුක සාධකය
නියැදි අණුක බර = භෂ්ම ගණන × 324
පරීක්ෂා කළ යුතු සාම්පලයේ පිටපත් අංකය (පිටපත්/උල්) = පරීක්ෂා කළ යුතු සාම්පලයේ සාන්ද්රණය / සාම්පලයේ අණුක බර × 6 × 1014
පිටපත් අංකය ගණනය කිරීමේ ක්රමය
ඉහත දැක්වෙන්නේ ප්රමාණය තීරණය කිරීම සඳහා ගණනය කිරීමේ ක්රමයයි.මෙය කනිෂ්ඨ උසස් පාසලෙන් උපාධිය ලැබීමෙන් පසු විසඳිය හැකි ගණිතමය ගැටළුවක් වන අතර ගණිතමය ගැටළු සාමාන්යයෙන් පරිගණක මගින් විසඳනු ලැබේ.ඔබට තේරෙන්නේ නැත්නම්, ඔබට සන්නිවේදනය කිරීමට පැමිණිය හැකිය.
සාපේක්ෂ ප්රමාණනය
සාපේක්ෂ ප්රමාණකරණය ප්රධාන වශයෙන් විද්යාත්මක පර්යේෂණ වලදී භාවිතා වේ.රුධිරයේ මිලි ලීටර් 1 ක වෛරස් කීයක් තිබේද, එය DNA වෛරසයකි, මෙය සාපේක්ෂ වශයෙන් නිශ්චිත සිදුවීමකි: රුධිර ප්රමාණය තීරණය කළ හැකි අතර DNA වෛරසය සාපේක්ෂව ස්ථායී වේ.කෙසේ වෙතත්, අපට කොළයක ඇති ජානයක පිටපත් ගණන සංසන්දනය කිරීම දුෂ්කර ය, මන්ද කොළයේ ප්රමාණය, බර සහ මෘදු බව තීරණය කිරීම දුෂ්කර බැවින් නිස්සාරණය කරන ලද RNA ප්රමාණය තීරණය කිරීම දුෂ්කර බැවින් ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව තීරණය කිරීම ද දුෂ්කර ය, එනම්, ඕනෑම පියවරකින් පර්යේෂණාත්මක දත්ත භාවිතා කළ නොහැක.
එබැවින්, සාපේක්ෂ ප්රමාණකරණය මූලද්‍රව්‍යයක් හඳුන්වා දිය යුතුය:අභ්යන්තර යොමු ජානය .
වෙනත් වචන වලින් කිවහොත්, සාපේක්ෂ ප්රමාණකරණය යනු ඉලක්කගත ජානය සහ අභ්යන්තර විමර්ශන ජානය අතර සැසඳීමකි.එකම පටකයේ සහ එකම සෛලයක සසඳන විට, නියැදි ප්‍රමාණයේ බලපෑම, RNA නිස්සාරණ ප්රමාණය, ප්රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව සහ PCR කාර්යක්ෂමතාවය සාපේක්ෂව කුඩා වේ.කුඩා සාම්පල ප්රමාණය නිසා අභ්යන්තර විමර්ශන ජාන සහ ඉලක්ක ජාන යන දෙකම සාපේක්ෂව අඩු විය.මේ නිසා තමයි අපි කලින් ඒකාකාරී බව සහ ස්ථාවරත්වය අවධාරණය කළේ.
අභ්යන්තර යොමු ජාන සාමාන්යයෙන් වේගෘහ පාලන ජාන(ගෘහ තබා ගැනීමේ ජාන), සියලුම සෛලවල ස්ථායීව ප්‍රකාශිත ජාන කාණ්ඩයකට යොමු වන අතර ඒවායේ නිෂ්පාදන සෛලවල මූලික ජීවන ක්‍රියාකාරකම් පවත්වා ගැනීමට අවශ්ය වේ.
මෙම සංකල්පය පටලවා නොගන්න.ගෘහ පාලන ජාන යනු ජීව විද්යාත්මක ක්‍රියාකාරී පද වන අතර අභ්යන්තර විමර්ශන ජාන පර්යේෂණාත්මක තාක්ෂණික පද වේ.ගෘහ පාලනයේ ජාන අභ්යන්තර විමර්ශන ජාන ලෙස තෝරා ගැනීමට පෙර වලංගුකරණය සමත් විය යුතුය.
උදාහරණයක් ලෙස, අපි විවිධ පටක සෛල තුළ ඒවායේ ප්‍රකාශන මට්ටම් පරීක්ෂා කිරීමට පහත රූපයේ ගෘහ පාලන ජාන කිහිපයක් තෝරා ගත් අතර, β-2-මයික්‍රොග්ලොබියුලින් ප්‍රකාශන මට්ටම් අනෙක් ජාන තුනේ ප්‍රකාශන මට්ටම්වලට වඩා බෙහෙවින් වෙනස් බව සොයා ගත්තෙමු, එබැවින් ඒවා අභ්යන්තර විමර්ශන ජාන ලෙස භාවිතා කළ නොහැක.
අභ්යන්තර විමර්ශන ජානයේ නිවැරදි කිරීමේ කාර්යය අවබෝධ කර ගැනීමෙන් පසුව, අභ්යන්තර විමර්ශන ජානය හඳුන්වාදීම හේතුවෙන් ඇල්ගොරිතම දෙකක් ව්‍යුත්පන්න වේ.
· ද්විත්ව සම්මත වක්ර ක්රමය
·2 – △△Ct ක්රමය (CT අගය සැසඳීමේ ක්රමය)
ඔබ විශේෂ සහ ජාන ක්‍රියාකාරකම් අධ්‍යයනය කිරීමට කැමති නම්, කරුණාකර ඇල්ගොරිතම පිළිබඳ පර්යේෂණ අත්හැර සූත්‍ර කෙලින්ම භාවිතා කරන්න, නැතහොත් යන්ත්‍ර කෙලින්ම භාවිතා කරන්න;ඔබ ගණිතය සහ ඉංජිනේරු විද්‍යාව පිළිබඳ කෙලින් පුද්ගලයෙක් නම්, කරුණාකර නිදහස් වන්න.
ද්විත්ව සම්මත වක්ර ක්රමය
පාලන නියැදියේ ඉලක්කගත ජානය සහ ගෘහ පාලන ජානය සහ සම්මත වක්රය හරහා පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදිය ප්‍රමාණ කරන්න, ඉන්පසු සාපේක්ෂ ප්‍රකාශන මට්ටම වන ගණනය කිරීමේ සූත්‍රයට අනුව සාපේක්ෂ අගය ගණනය කරන්න.
වාසි: සරල විශ්ලේෂණය, සාපේක්ෂ සරල පර්යේෂණාත්මක ප්රශස්තකරණය
අවාසිය: සෑම ජානයක් සඳහාම, එක් එක් පරීක්ෂණ වටයක් සම්මත වක්රයක් සෑදිය යුතුය
යෙදුම: ජාන ප්‍රකාශන නියාමනය අධ්‍යයනය කිරීමේදී බහුලව භාවිතා වන සහ පිළිගත් සාපේක්ෂ ප්රමාණාත්මක ක්රම දෙකෙන් එකක්
සූත්රය පහත පරිදි වේ:
උදාහරණ පහත පරිදි වේ:
ප්රමාණාත්මක ප්රතිඵලය මත පදනම්ව සාපේක්ෂ මුදල ගණනය කරන්න
2 – △△Ct ක්රමය (CT අගය සැසඳීමේ ක්රමය)
වාසි: සම්මත වක්රයක් සෑදීමට අවශ්ය නොවේ
අවාසි: විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 100% ට ආසන්න බව උපකල්පනය කෙරේ;සම්මත අපගමනය < 5% වන අතර, සම්මත වක්රය සහ එක් එක් විස්තාරණය අතර කාර්යක්ෂමතාවය අනුකූල යැයි උපකල්පනය කෙරේ;පර්යේෂණාත්මක තත්ත්වයන් ප්‍රශස්ත කිරීම වඩාත් සංකීර්ණ වේ.
යෙදුම: ජාන ප්‍රකාශන නියාමනය අධ්‍යයනය කිරීමේදී බහුලව භාවිතා වන සහ පිළිගත් සාපේක්ෂ ප්රමාණාත්මක ක්රම දෙකෙන් එකක්
ඇත්ත වශයෙන්ම, විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව සාමාන්යයෙන් පරිපූර්ණ විය නොහැක 1. නිවැරදි කිරීමේ ක්රමය: ඉලක්කගත ජානය සහ විමර්ශන ජානය එකම විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාවයක් ඇති බව අපි දනිමු, නමුත් විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව 1 ට සමාන නොවේ නම්, 2－△△Ct ලෙස නිවැරදි කළ හැක: (1+E )－△ සඳහා උදාහරණය: (1+E ) ගණනය කිරීමේ සූත්රය 1.95△△Ct ලෙස නිවැරදි කළ හැක
මෙතෙක්, ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR පිළිබඳ අන්තර්ගතය අවසන් වී ඇත.
පසු කාලය: අප්රේල්-06-2023
